利用質譜儀開展的蛋白組學研究中，質譜的掃描速度會影響蛋白的鑒定深度。與傳統3D蛋白組學保留時間、質荷比、離子強度相比，timsTOF Pro雙TIMS/PASEF分離技術，使得蛋白質組學進入4D蛋白質組學新時代。4D分離技術增加第四個維度—離子淌度（mobility），進而大幅提高掃描速度和檢測靈敏度，提升蛋白鑒定的數量和覆蓋率。

本期推送用2個研究案例帶你了解基于timsTOF Pro的4D蛋白質組學到底好在哪？一起來看看吧！

案例一

發表在Metabolites上的一項題為“Proteomic Analysis of Tears and Conjunctival Cells Collected withSchirmer Strips Using timsTOF Pro: Preanalytical Considerations”的研究采用timsTOF Pro對淚液及結膜細胞進行蛋白質組學分析，該研究強調了結合高數據采集速度和timsTOF Pro中基于離子遷移率的分離，可以為淚液等有限樣本的生物標志物研究帶來新的維度[1]。

研究利用timsTOF Pro，采用全面的蛋白質組學方法，研究從整個 (W, whole) 淚液檢測濾紙 (ScS, Schirmer strips) 及其兩個部分--結膜囊內部分 ( B, bulb) 和濾紙的其余部分 (R, rest of the strip) 采集的樣本的人類蛋白質組圖譜。從兩名健康受試者的四次不同就診中收集8個ScS，分為三批，即4W、4B和4R。在W、B和R批次中總共鑒定出1582種蛋白質。在所有已鑒定的蛋白質中，結合蛋白 (43.4%) 和具有催化活性的蛋白 (42.2%) 占分子功能的80%以上。最具代表性的生物過程是細胞過程 (31.2%) 、代謝過程 (20.8%) 和生物調節 (13.1%)。酶是最具代表性的蛋白質類 (41%)，主要由水解酶 (47.5%)、氧化還原酶 (22.1%) 和轉移酶 (16.7%) 組成。與結膜接觸的部分 (B) 可能由于同時收集淚液和細胞蛋白質，因此有助于更多蛋白質的鑒定。

研究對來自三組（W、B和R）的所有已鑒定蛋白質進行GO富集分析發現，timsTOF Pro的強大之處在于，它可以分離具有相同質量電荷比 (m/z) 的不同分子，圖1顯示了如何通過對兩個具有幾乎相同質量的靶向肽（白細胞彈性蛋白酶抑制劑和免疫球蛋白）進行測序來評估肽表征。這些蛋白質以相同的保留時間和非常相似的m/z進行共洗脫，但由于timsTOF Pro的三維離子遷移特性，這些肽被區分開來。

圖1 離子遷移率的可視化熱圖。timsTOF-Pro分析表明，在一個時間點，兩種不同蛋白質的肽離子具有幾乎相同的質量電荷比 (m/z)。圓圈線表示兩個前體離子的m/z和遷移率位置，這兩個前體離子通過平行累積連續碎裂技術 (PASEF) 進行碎裂。

案例二

發表在J ProteomeRes上的一項題為“Ultrafast and Reproducible Proteomicsfrom Small Amounts of Heart Tissue Enabled by Azo and timsTOF Pro”的研究開發了一種由Azo（一種可光降解、與MS兼容的表面活性劑，可有效溶解蛋白質并促進快速胰蛋白酶消化）與Bruker timsTOF Pro相結合的超快全面蛋白質組學方法，該方法通過捕獲離子遷移譜 (TIMS) 和肽的平行累積連續碎裂技術 (PASEF) 實現更深的蛋白質組覆蓋。研究通過應用該方法分析復雜的人類心臟蛋白質組，并在一次高重復性的一維LC-TIMS-MS/MS運行中，從1 mg人類心臟組織中鑒定出近4000個蛋白質組。總的來說，預計這種由Azo和timsTOF Pro相結合的超快速、穩健和可重復的全面蛋白質方法將普遍適用，并大大加快大規模定量蛋白質組學研究的速度[2]。

文章中提到，由于心臟蛋白質組是高度復雜的，timsTOF Pro增強的敏感性使蛋白質組覆蓋范圍更廣。timsTOF Pro在不犧牲靈敏度的情況下，通過PASEF大大提高了MS/MS測序速度。在這種模式下，從LC柱中共稀釋的離子在TIMS單元中并行累積，根據其TIMS遷移率分離為離散的數據包，然后，結合快速四極切換，連續噴射并經受MS/MS（圖2B）。該過程顯著增加了從K562全細胞裂解物消化物中鑒定出的作為參考標準的蛋白質組和肽的數量。利用PASEF，研究能夠從三次注射的200 ng K562全細胞裂解液中鑒定出6364個蛋白質組和60159個肽，相比之下，在PASEF和TIMS被禁用的同一樣本中，只有2531個蛋白質組和15815個肽，這說明了PASEF能夠極大地擴大蛋白質組的覆蓋范圍。

圖2 在timsTOF Pro上使用Azo和PASEF的全面蛋白質組學工作流程。(A) 樣品制備，包括 (1) 組織切割（可擴展至1mg組織），(2) 光降解表面活性劑偶氮中的組織均質，(3) 快速胰蛋白酶消化（最快30分鐘），以及 (4) 在 (5) RPLC-TIMS-MS/MS之前的偶氮降解和C18脫鹽。(B) timsTOF Pro上的PASEF示意圖，展示了

SBC 蛋白研究技術平臺

SBC擁有業內高水平的蛋白研究技術平臺，timsTOF Pro液質聯用儀、Simoa數字單分子免疫陣列分析儀、ELISA和Western Blot實現蛋白質組學分析和驗證，涵蓋蛋白質定性、定量和修飾研究。

參考文獻：

[1]Akkurt Arslan M, Kolman I, Pionneau C, et al. Proteomic Analysis of Tears and Conjunctival Cells Collected with Schirmer Strips Using timsTOF Pro: Preanalytical Considerations. Metabolites. 2021;12(1):2. Published 2021 Dec 21. doi:10.3390/metabo12010002

[2]Aballo TJ, Roberts DS, Melby JA, Buck KM, Brown KA, Ge Y. Ultrafast and Reproducible Proteomics from Small Amounts of Heart Tissue Enabled by Azo and timsTOF Pro. J Proteome Res. 2021;20(8):4203-4211. doi:10.1021/acs.jproteome.1c00446