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細菌內毒素(脂多糖)的提取之PCP法、高壓超聲處理法及DMSO法的介紹

瀏覽次數:1533 發布日期:2022-9-9  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

一、苯酚╱氯仿╱石油醚法PCP)
LPS分子鑲嵌于胞壁的外膜中,用某些化學試劑將胞壁裂解(如酚)后,LPS分子從破潰的胞壁中游離出來。由于LPS是一種兩性分子,故它們在不同溶劑中的溶解度,完全取決于該分子上的親水/疏水性基團的多少。S-LPS有完整的親水性О特異性側鏈,所以S型LPS屬親水性分子。而R型LPS,缺乏O特異性側鏈,含有完整或不完整的核心多糖和完整的類脂A,親水度不大,而易溶于有機溶劑中,故而R-LPS用酚水法提取時所得的產量極低。


PCP法是以90%苯酚、氯仿及石油醚(40~60℃)以2:5:8所組成的單相混合提取液,這一提取方法只能將LPS及與之緊密結合的透道蛋白(Porin)提取出來,而其它成分則排除在提取液外。PCP法的水沉淀步驟僅能使LPS發生沉淀,而透道蛋白仍溶于苯酚中,故而PCP法所提取的LPS是一種較為純化的制劑。

PCP法對制取R型細胞的LPS產量十分滿意,且無核酸污染,蛋白質含量也僅在0.1~1 %間,該法溫和,在室溫5~20℃即可完成,制取周期較短,適用于從Ra至Re的細菌,可成功地提取R-LPS,產量也相當高。故PCP法是研究R-LPS的有用方法。應必須注意的是在PCP法中,每一步操作均不應使用鹽類,如MgCl2、CaCl2,否則會嚴重影響產量。

 


二、高壓超聲處理法
以某些物理方法(如超聲波)處理菌體細胞,使其完全破裂,可增加繼后提取方法的完全性,從而可使LPS的產率增加。Richard1983研制了一種既可提取光滑型又可提取粗糙型LPS的新方法。該方法采用了高壓處理(15000Ib/in2)細菌的方法,粉碎菌細胞,繼又用超聲波處理,促進碎片完全裂解,再以DNa s e,RNa s e處理,消化核酸。再加入蛋白酶去消化蛋白質,離心12000xg,濃縮干燥。如此制得的LPS,產量為菌體的51~81%(按測脂肪酸、庚糖和KDO值),蛋白質為0.1%、核酸1 %、脂類2~5%,純度較高,產量比酚水法高7倍,比PCP法高2倍。


所得LPS經各種免疫化學分析,均提示用此方法提取的LPS其抗原結構完整。其不足之處是堿性條件上的加熱,以前認為這一處理在于除掉蛋白質,特別是對于有些細菌(如綠膿桿菌)有用,但對別的細菌恐屬多余。應當指出的一點是,堿性加熱條件使類脂體A上的脂肪酸酯降解。另外一個不足之處是,此方法較為復雜,不易被一般實驗室采用。

三、DMSO法
Adams介紹了一種較為簡單的LPS提取方法。該法應用二甲亞砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO)作為主要提取試劑。以胞壁原料提制LPS。主要步驟為將預先制取的干燥胞壁以60℃DMSO提取水洗,酸化丙酮處理,冷凍干燥。DMSO法提取的LPS產量是酚水法的10倍,但蛋白質含量很高(45%) 。

發布者:科德角國際生物醫學科技(北京)有限公司
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