類器官（Organoids）是指利用成體干細胞或多能干細胞進行體外三維（3D）培養而形成的具有一定空間結構的組織類似物。其與對應的人類器官擁有高度相似的組織學特征，并能重現該器官的生理功能。與傳統2D細胞培養模式相比，3D培養的類器官包含多種細胞類型，突破了細胞間單純的物理接觸聯系，形成了更加緊密的細胞間，細胞與基質間高度相互作用，形成具有功能的“微器官”，能更好地用于模擬器官組織的發生過程及生理病理狀態，因而在基礎研究、臨床診療、藥物模型等多方面均具有廣闊的應用前景。

 

然而在類器官培養過程中的拍攝及定量分析有著許多挑戰：

1、人工手動操作拍攝類器官圖像，費時耗力通量低；

2、頻繁采集過程當中環境變化對類器官帶來影響；

3、常規顯微鏡下僅能得到類器官面積信息，數據量少；

4、孔板中拍攝位點難以全面選取，重復性難以保證。

 

Holomonitor M4強大的全息動態監測及分析功能助您輕松解決類器官拍攝過程中的痛點，Holomonitor M4機身小巧可在培養箱中長期無標記實時監測類器官避免環境變化干擾；針對不同的孔板可進行多處自由選點保證實驗重復性，最高可進行96孔板監測；3D成像及強大的分析功能不僅可以提供類器官面積形態變化信息，更能給與體積及遷移等豐富信息。

 

下面給大家分享一篇類器官拍攝及定量分析案例。

案例一

Subpopulations of Organoid-Forming Cells Have Different Motility

 

 

口咽鱗狀細胞癌（OPSCC）干細胞具有自我更新和分化成腫瘤異質三維結構的能力。David等人采用實時數字全息顯微鏡（Holomonitor M4）對口咽鱗狀細胞癌進行腫瘤類器官形成觀察。監測結果展示了腫瘤-類器官形成早期細胞聚集的過程，并可對類器官面積及光學體積進行篩選。隨后David等人對OPSCC上皮細胞進行分選，通過M4對不同表型的細胞運行及生長觀察結果表明CD44＋細胞表現出更大的運動性和腫瘤形成能力。Holomonitor M4提供了一種簡單無標記的腫瘤類器官長期監控分析，可用于評估類器官形成過程、類器官生長面積及體積量化分析、類器官遷移追蹤及藥物篩選。

 

應用一

監控類器官形成數量，評估類器官最佳接種密度。

 

亮點：Holomonitor M4機身小巧可在培養箱中長期無標記實時監測類器官避免環境變化干擾。

 

本文通過15小時連續觀測不同接種密度下細胞發生聚集形成類器官時間，并通過光學厚度的數據來評估整體生長狀況。結果表示接種密度100個細胞/ μL可產生102個±36個類器官/mm²;1000 個細胞/μL 產生 47 ± 34 個類器官/mm²。接種密度會影響類器官的大小和光學性質，細胞之間的密切接觸，有利于類器官的形成。

圖1: 用HoloMonitor M4成像測定類器官的接種密度條件和光學性質。口咽鱗狀細胞癌（OPSCC）細胞在以（a）100和（b）1000個細胞/ μL的密度接種后15小時成像，（c）散點圖顯示使用不同接種密度獲得的類器官的光學體積和厚度。

 

應用二

長期監控并實時量化類器官生長狀態

 

亮點：HoloMonitor M4 3D成像及強大的分析功能，實時量化類器官面積及體積變化信息。

 

本文通過15小時聯系觀測，評估影響類器官形成和生長的事件，結果表明顯示類器官在接種后2 h開始形成，并通過面積和光學厚度隨時間的增加來監測整體生長。在最初的8小時內，細胞聚集主導了類器官的形成；在8-15 h時類器官完全形成，并顯示出穩定的直徑和光學厚度測量結果。

 

圖2：使用M4監測15小時內的類器官形成情況。（a）水凝膠嵌入培養系統不同時間點（0,7.5和15小時）捕獲的M4圖像。（b）五個類器官在15小時內的面積和光學體積增加情況。

應用三

不同基因型細胞形成類器官能力及其運動情況分析

 

亮點：HoloMonitor M4可針對不同的孔板可進行多處自由選點，可以保證實驗重復性；強大的分析功能給出細胞遷移距離及速度等豐富信息。

 

在OPSCC類器官形成過程中，14%細胞沒有形成任何3D結構，表明可能存在具有不同類器官形成能力的細胞亞群。通過根據CD44和NGFR（表達對單個OPSCC細胞的類器官形成能力和運動差異性進行分類來進行評估。分選后三種不同表型的細胞，CD44 +/ NGFR+，CD44+ / NGFR−和 CD44−/NGFR−，在水凝膠中接種并使用HoloMonitor M4進行跟蹤。結果顯示CD44＋表達的細胞在15h內可以形成類器官且顯示出更大的平均運動性（140-240μm），而CD44−腫瘤細胞無法形成類器官且在水凝膠移動緩慢（〜30μm）。 

 

 

圖3：不同口咽鱗狀細胞癌-細胞表型的類器官形成能力和運動性。（b）根據CD44和NGFR的表達獲得單個細胞的平均累積運動性，對五個表型的類器官進行重復監測。

 

參考文獻：

[1] Gomez Jimenez D, Carreira Santos S, Greiff L, et al. Subpopulations of Organoid-Forming Cells Have Different Motility. Applied Sciences. 2020; 10(13):4673.

https://doi.org/10.3390/app10134673.

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