光學相干斷層掃描（OCT）能以細胞尺度分辨率對幾毫米的活體組織進行實時三維成像，但在功能生物學研究方面，仍缺乏可很好與組織區(qū)分開來的外源性造影劑從而導致應(yīng)用受限。基于此，斯坦福大學研究人員Orly Liba等開發(fā)了一種功能性O(shè)CT成像方法，稱為“MOZART”。該方法使用采用LGNRs（large gold nanorods）作為造影劑并結(jié)合特定算法進行光譜識別。LGNRs每粒子的光譜信號比傳統(tǒng)GNR高110倍，使得能夠從水中檢測出單個LGNR，在活小鼠循環(huán)中的檢出濃度可低達250 pM。該方法還能夠自適應(yīng)地補償深度并處理偽像。總的來說，該方法能夠在活體中實現(xiàn)高質(zhì)量的非侵入性對比增強OCT成像。此外通過不同光譜的LGNR復用可以觀察淋巴引流的離散模式，并識別單個淋巴管和淋巴管瓣膜的功能狀態(tài)。研究成果以“Contrast-enhanced optical coherence tomography withpicomolar sensitivity for functional in vivo imaging”為題發(fā)表于Scientific Reports。

 背景
 通過使用分子造影劑，正電子發(fā)射斷層掃描和光聲成像等技術(shù)，活體內(nèi)功能成像領(lǐng)域取得了一系列重大進展，組織穿透性更好。然而這些技術(shù)的空間分辨率仍較差，單個圖像體素可能包含10³-10⁷個細胞。其他成像方式如光學顯微鏡，分辨率很容達到亞細胞水平，但在混濁組織中成像深度不超過幾百微米。因此，迫切需要具有細胞尺度分辨率的功能性體內(nèi)成像技術(shù)。OCT使用低相干的干涉法實現(xiàn)微米級的空間分辨率和毫米級的穿透深度，似乎能填補當前功能成像技術(shù)空白。迄今為止，OCT的應(yīng)用主要集中在組織結(jié)構(gòu)或血流和氧合的研究中。有研究試圖通過使用各種納米粒子將OCT用于分子成像，最常見的是使用金納米棒（GNRs）。但這些傳統(tǒng)粒子的總消光主要是吸收而不是散射，致使OCT對比度較差。而且通常用于生物醫(yī)學成像的GNR較小（約50×15 nm），散射不光足以突破內(nèi)源性組織信號，而大一些的GNR的散射截面會有顯著增加，雖然已經(jīng)有研究將其用于生物應(yīng)用，但還處于探索階段。此外這些研究主要在體外進行，背景散射明顯小于真實組織。因此，外源因子的信號對于實現(xiàn)OCT分子成像至關(guān)重要，需要能從活體組織的內(nèi)在信號中區(qū)分出來。

 本文旨在證明使用對比增強OCT可以在活體內(nèi)進行功能成像。根據(jù)之前研究，使用大的適用于生物用途的GNRs（約100× 30 nm，即LGNRs）作為OCT造影劑。使用SD-OCT（Spectral Domain OCT）系統(tǒng)和定制的光譜算法，活體內(nèi)檢測了這些GNR試劑。發(fā)現(xiàn)LGNRs每粒子產(chǎn)生的光譜信號是傳統(tǒng)GNR的約110倍，且活體內(nèi)LGNR檢測靈敏度可達至少250 pM。使用該系統(tǒng)無創(chuàng)成像觀察了腫瘤組織中750 μm深度的小血管（直徑約20 μm），以及小鼠耳淋巴網(wǎng)絡(luò)中液體引流的空間模式。除此之外，對比增強型OCT圖像還用來確定維持單向淋巴流動的淋巴管的位置和功能狀態(tài)。為體內(nèi)靶向分子成像研究提供了一個理想的平臺。   圖1 MOZART及其活體內(nèi)成像能力總覽。（a）傳統(tǒng)OCT掃描小鼠耳廓。（b）MOZART結(jié)合使用SD-OCT和造影劑LGNR，以及定制的處理算法，產(chǎn)生的圖像包含體內(nèi)功能性信息。MOZART圖像以不同光譜展示皮下注射的LGNR，引流到淋巴管為綠色和青色，引流到血管為紅色。

 結(jié)果
 01-后處理算法
 OCT依靠低相干光干涉來檢測樣品中散射體的位置，SD-OCT則是通過對獲得的干涉信號光譜進行傅里葉變換來確定散射體位置，這種標準方法產(chǎn)生的圖像帶有純粹的結(jié)構(gòu)信息（圖2a）。研究人員結(jié)合定制處理算法，將原始的SD-OCT干涉圖分成兩個光譜不同的子集即Band 1和Band 2，大致對應(yīng)900-1000 nm和800-900 nm的波長范圍（圖2c）。分別重建兩個子集的干涉圖，從總干涉圖重建的OCT圖像中減去它們并除以O(shè)CT圖像。將重建波段之間的差異定義為光譜信號，將重建波段之間的歸一化差異定義為光譜對比度（圖2d）。  

 

圖2 后處理步驟及結(jié)果。（a）OCT對數(shù)強度圖像，展示IV注射LGNR后耳廓中腫瘤的結(jié)構(gòu)。（b）流動檢測算法結(jié)果。圖像中含血管下的垂直陰影，是散斑方差法檢測流動的典型偽影。（c）干涉圖被分成兩個波段，以實現(xiàn)雙波段檢測LGNR。（d）光譜對比度的對數(shù)表示。（e）迭代色散補償后的圖d。（f）應(yīng)用深度相關(guān)增益的圖e，以補償深度相關(guān)光譜像差。（g）血流檢測與光譜對比度相結(jié)合，產(chǎn)生注射LGNR后腫瘤血管的光譜圖。血管中的LGNRs顯示為黃綠色。由于血管下方組織的光譜中性，LGNRs下方區(qū)域呈現(xiàn)紅色。（h）圖g結(jié)合OCT強度信號以顯示組織解剖結(jié)構(gòu)。
 

在OCT中，當光通過色散介質(zhì)時，樣品臂和參考臂之間的光程長度不匹配會導致色散，OCT系統(tǒng)中的光學元件和樣品本身也會導致色散。可在后處理圖像重建期間通過添加與波數(shù)成平方關(guān)系的相位進行色散補償，此外還有光譜偽影，因此研究人員也開發(fā)了自適應(yīng)方法進行相應(yīng)補償（圖2e，f）。
 

將血流檢測（描繪為圖像強度）與光譜對比度（描繪為圖像色調(diào)）相結(jié)合，產(chǎn)生血流門控圖像（圖2g）。血流和光譜對比度也與組織結(jié)構(gòu)相結(jié)合，實現(xiàn)光譜和功能信息的同時可視化（圖2h）。
 02-LGNR造影劑在OCT中的應(yīng)用

 本研究合成了一種較大的GNR（LGNR），尺寸約100× 30 nm的LGNR，通過透射電子顯微鏡測量發(fā)現(xiàn)，LGNRs在815 nm處顯示出縱向表面等離子體共振（LSPR）峰值，并且消光系數(shù)比等效等離子體共振的常規(guī)GNRs大約8倍（圖3a）。還制備了另一批925 nm LSPR的LGNRs用于多重研究。
 除光散射強度外，生物穩(wěn)定性和無毒性也至關(guān)重要。研究人員用methoxy-PEG-SH包被LGNRs-PSS，即PSS（poly sodium 4-styrenesulfonate，MW約70 kDa）溫育LGNRs產(chǎn)生的顆粒，在DDI H₂O和FBS中都非常穩(wěn)定，隨后洗滌以產(chǎn)生LGNRs-PSS-mPEG，確保生物相容性和無毒性。將LGNRs-PSS-mPEG用于所有淋巴成像實驗。還制備了由非特異性IgG1抗體包被的LGNRs-PSS（LGNRs-Ab），用于進一步的分子靶向?qū)嶒灒�同時也證明了LGNRs-PSS的廣泛應(yīng)用性，可以很容易地用抗體進行修飾。
 為證明LGNR在對比增強型OCT中的顯著優(yōu)勢，體外比較了LGNR和GNR的OCT信號。使用具有同等LSPR的LGNRs和GNRs，LGNRs每粒子產(chǎn)生的OCT強度比GNRs高約30倍。光譜檢測的使用額外改善了LGNR信號，使得LGNRs顯示出比GNRs大約110倍的光譜信號（p< 0.001，圖3b，c）。LGNRs散射增加的部分原因是它們的橫截面積更大。
 

 

圖3 GNR和LGNR對比的評估。（a）相同的納米粒子濃度（nps/ml）下，LGNRs的總消光比傳統(tǒng)GNR大約8倍。（b）以同等的粒子濃度（1× 10¹⁰ mps/ml）制備時，LGNR的OCT信號比GNR大得多。（c）對b中標出的區(qū)域進行的定量分析表明，LGNR的OCT強度比GNR強約30倍，光譜信號比GNR強約110倍（*p< 0.001）。（d）血液中LGNR濃度增加的對數(shù)OCT強度。（e）d中樣品的光譜對比度，顯示隨著LGNR濃度的增加，光譜色調(diào)從紅色增加到黃綠色。虛線為用于光譜對比度量化的區(qū)域。（f）血液中LGNR濃度的光譜對比度的量化。
 

使用本文的光譜處理算法，能夠檢測到水溶液中的單個LGNR（圖2b）。在OCT圖像中觀察到的亮點數(shù)量與成像體積中給定LGNR濃度下單個粒子的預期數(shù)量一致。
 

 03-體外成像靈敏度

 使用新采集的大鼠全血進行體外成像靈敏度探究，發(fā)現(xiàn)使用該系統(tǒng)光譜分析方法檢測LGNR的靈敏度為50 pM（p< 0.001），表明LGNRs容易產(chǎn)生在生物背景中可區(qū)分的OCT光譜對比度（圖3d-f）。
  04-活體內(nèi)LGNR靈敏度和循環(huán)時間
 通過對小鼠腫瘤異種移植模型成像，證明該系統(tǒng)在活體內(nèi)檢測LGNRs的能力。在雌性裸鼠（nu^-/nu^-）右耳耳廓接種U87MG細胞。腫瘤細胞注射后7天，以20 μL的增量靜脈注射LGNRs-Ab（250 μL，濃度23.5 nM），每次注射后獲取截面OCT圖像，并測量血管中的光譜對比度。研究發(fā)現(xiàn)，雖然血管最初表現(xiàn)出中性光譜信號，但注射LGNR-Ab后，血管中觀察光譜偏差強烈朝向LGNR-Ab峰（圖4a）。光譜分析能夠檢測小鼠耳脈管系統(tǒng)中低至250 pM（p < 0.001）濃度的LGNRs-Ab（圖4b）。藥代動力學方面，基于注射后24h內(nèi)的光譜定量，LGNRs-Ab的光譜對比循環(huán)半衰期（t_1/2）約為18h（圖4c），因此抗體修飾的LGNRs在分子靶向研究中也有很大的應(yīng)用潛力。  

 

圖4 體內(nèi)腫瘤模型中OCT圖像的對比度增強。（a）靜脈注射LGNRs-Ab前后的OCT對數(shù)強度圖像和組合光譜對比圖像。在血管中檢測到LGNRs-Ab，注射前為紅色，注射后為黃綠色。LGNRs-Ab增強了觀察腫瘤深處小血管的能力（白色箭頭）。（b）在LGNRs-Ab靜脈遞增注射期間血管中的光譜信號。能夠從第一次增量注射中檢測到LGNRs-Ab，相當于血液中LGNRs-Ab濃度為250 pM（*p< 0.001）。（c）靜脈注射LGNRs-Ab前和注射后24h血管中的光譜信號。（d）注射LGNR-Ab前及注射后0、16、24 h腫瘤血管（白色虛線圈出）和鄰近健康組織中光譜對比信號的3D體積視圖。
  05-腫瘤中的LGNR成像
 體積式OCT圖像顯示，在注射LGNR-Ab前，健康耳組織和腫瘤組織之間的血管形態(tài)存在差異，而健康血管系統(tǒng)和腫瘤血管系統(tǒng)的信號在光譜上都是中性的。注射LGNR-Ab后，兩者脈管系統(tǒng)中都觀察到光譜對比度顯著增加，且由于LGNRs-Ab的反向散射增加，還可觀察到許多額外的小血管，特別是在腫瘤內(nèi)部（圖4d）。
  06-LGNR復用以成像功能性淋巴引流
 有研究使用OCT來識別淋巴管網(wǎng)絡(luò)，但無法提供關(guān)于功能性淋巴流動的信息，如引流的組織區(qū)域或淋巴流動方向。研究人員使用MOZART系統(tǒng)對小鼠耳廓初始淋巴管中液體引流的空間依賴性進行成像。在注射之前采集的流動門控OCT圖像描繪出血管系統(tǒng)（圖5a）。注射815 nm的LGNR-PSS-mPEG（2 μL，濃度8.5 nM）后，立即觀察到廣泛的引流淋巴管網(wǎng)絡(luò)，直徑小至約20 μm（圖5b）。30 min后，在距離第一個注射部位約1 mm處注射光譜不同的925 nm LGNRs-PSS-mPEG（2 μL，濃度8.5 nM）。使用光譜分析來區(qū)分兩種LGNR，觀察到幾個之前看不到的淋巴管從925 nm LGNR注射部位引流。有趣的是，在第一次注射后顯示出強815 nm LGNR信號的幾個淋巴管在第二次注射后，顯示出925 nm LGNR信號或混合LGNR信號。一些包含混合光譜信號的淋巴管顯示出離散的光譜對比度，而不是兩個LGNR光譜的平均值（圖5c）。
 健康淋巴管功能和哺乳動物免疫中的關(guān)鍵是間質(zhì)液的單向引流和細胞向淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)運。淋巴管通過流體壓力和兩端的瓣膜功能保持液體的單向流動。MOZART系統(tǒng)能夠區(qū)分出引流網(wǎng)絡(luò)中的單個淋巴管（圖5d，e）。多重LGNRs-PSS-mPEG的順序注射也可以推斷淋巴管的功能狀態(tài)，是否能維持單向引流。其中單向瓣膜功能的影響非常明顯，不同淋巴管匯集到于此，引流的不同光譜LGNR匯集進入下游淋巴管中（圖5f）。  

 

圖5 LGNRs-PSS-mPEG引流到耳廓淋巴管的活體內(nèi)研究。（a）流動檢測的正面視圖，顯示注射前的血管（紅色）。（b）光譜對比顯示第一次注射815 nm LGNR（綠色）。（c）第二次注射925 nm LGNR后（青色-藍色）。LGNRs正在填充淋巴管，并從耳邊緣的注射部位（圖像頂部）引流向耳朵底部（圖像底部）。（d）另一只小鼠左側(cè)注射815 nm LGNR后的正面圖。（e）d中虛線區(qū)域的特寫圖，顯示淋巴網(wǎng)絡(luò)中的連接。可以清楚觀察到相鄰淋巴管之間瓣膜的位置（白色箭頭）。（f）與e同一個區(qū)域注射925 nm LGNR后。815 nm和925 nm LGNRs都到達淋巴連接。連接處左側(cè)的淋巴管仍含有815 nm LGNR（綠色），而右側(cè)以前未發(fā)現(xiàn)的淋巴管和連接處下游的淋巴管顯示925 nm LGNR（青色-藍色）。

 結(jié)論
 本研究使用的對比增強型OCT成像平臺，即MOZART，在小動物中實現(xiàn)了活體功能性成像研究。其中的LGNR造影劑功能化方便且靈敏度高，自適應(yīng)光譜處理算法可以實現(xiàn)無相差、高對比度的OCT體內(nèi)研究。此外LGNR復用實現(xiàn)了對淋巴引流的可視化，能夠觀察到淋巴網(wǎng)絡(luò)中單獨淋巴管以及淋巴瓣膜的功能狀態(tài)。證明該平臺在體內(nèi)分子研究中的良好應(yīng)用性，在臨床前研究中，該平臺可用于研究分子腫瘤異質(zhì)性及淋巴管網(wǎng)絡(luò)等。此外也有專門用于視網(wǎng)膜成像的OCT儀器，因此該平臺也可用于研究視網(wǎng)膜疾病。

 

參考文獻

Liba, Orly , et al. "Contrast-enhanced optical coherence tomography with picomolar sensitivity for functional in vivo imaging." Scientific Reports 6(2016):23337.