注    意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
在食品中，亞硝酸鹽可與肉品中的肌紅素結(jié)合而更安定，在食品加工業(yè)中作為保色劑，以維持肉制品的良好外觀，并防止肉毒梭狀芽孢桿菌的產(chǎn)生，提高食用肉制品的安全，但是人體長期攝入亞硝酸鹽過量的食品，可誘發(fā)消化系統(tǒng)癌變。
 
測定原理：
在酸性條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸反應(yīng)生成重氮化合物，再與N-1-萘基乙二胺形成紫紅色偶氮化合物，在540nm處有特征吸收峰。
 
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
天平、研缽或勻漿器、水浴鍋、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水。
 
試劑組成和配制：
提取液一：液體50 mL×1瓶，室溫保存。
提取液二：液體50 mL×1瓶，室溫保存。
提取液三：液體50 mL×1瓶，室溫保存。
粉劑四：粉劑 100 mg ×1支，室溫保存。
試劑一：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑二：液體10mL×1瓶，4℃避光保存。
 
樣品處理：
稱取樣品約0.2g鮮重或0.05g干重，破碎，加入0.5 mL 提取液一，沸水浴15min，冷卻至室溫，加入0.5 mL提取液二，震蕩搖勻，加0.5 mL 提取液三，用鑷子加少量粉劑四（約1 mg），靜置30min，25℃，8000g離心15 min，取上清液待測。
 
測定步驟和操作表：

• 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長至540nm，蒸餾水調(diào)零。
• 操作表

	測定管	空白管
蒸餾水（µL）		70
樣品（µL）	70
試劑一（µL）	65	65
試劑二（µL）	65	65
混勻，25℃靜置15min，于微量石英比色皿/96孔板中檢測540nm處吸光值A(chǔ)。     △A=A測定 - A空白

 
注意：空白管只需測定一次。
 
亞硝酸鹽含量計算：

• 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.234x + 0.0002，R²= 0. 999  x為標(biāo)準(zhǔn)品亞硝酸鈉濃度（μg/ml） y為吸光值A(chǔ)。
NO₂^-（μg/g）=（△A-0.0002）÷0.234×V樣÷（V樣÷V樣總×W）×0.6668
                     =（A – 0.086）÷0.234×1.5×0.6668÷W
                     =4.27×（△A-0.0002）÷W
V樣總：加入提取液體積，1.5 mL； V樣：反應(yīng)中樣品體積，0.07mL；W：樣品質(zhì)量，g。
b.用96孔板測定的計算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.141x +0.095，R²= 0. 9991  x為標(biāo)準(zhǔn)品亞硝酸鈉濃度（μg/ml） y為吸光值A(chǔ)。 
NO₂^-（μg/g ）=（△A-0.0002）÷0.141×V樣÷（V樣÷V樣總×W）×0.6668
                    =（△A-0.0002）÷0.141×1.5×0.6668÷W
                    =7.09×（△A-0.0002）÷W
V樣總：加入提取液體積，1.5 mL； V樣：反應(yīng)中樣品體積，0.07mL；W：樣品質(zhì)量，g。
注意事項：

• 試劑盒2-8℃保存。
• 試劑對人體有一定的危害，請穿實(shí)驗(yàn)服，戴手套操作。
• 若檢測出得OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍外，請將樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)臐饪s或稀釋（A₅₄₀ <0.09濃縮，A₅₄₀ > 1.5 適當(dāng)稀釋）。
• 最低檢出限為0.5μg/g。