在基因治療領域，慢病毒載體(Lentivirus)是一種復制較慢的逆轉錄病毒，由HIV-1改造而來，常作為基因治療的載體使用。

    慢病毒載體的制備流程需要對病毒的物理滴度和感染滴度進行檢測。

    1. 現有的檢測手段（如p24 ELISA）因病毒中p24蛋白的含量不同、含有p24蛋白的雜質（如外泌體）等因素的影響，無法精準地表征病毒的物理滴度，且此類方法均無法對空載病毒（無p24蛋白）進行表征，這就給感染滴度的檢測帶來了誤差。

    2. 在復雜的病毒工業化制備流程中，只測量末端純化產品的滴度，無法真實反映各個生產環節的生產效率，而對各個生產環節的樣品都進行純化表征會浪費大量人力物力。目前研究者亟需一種無純化、快速、檢測下限低的病毒表征手段。

    3. 目前的病毒表征手段，均無法將病毒的物理參數如粒徑(與載體聚合相關)與蛋白質組分析聯系起來。因此，這些技術無法分析病毒滴度受樣品聚集或病毒破裂與分解影響的情況，因此無法區分單分散制劑與聚集樣品。
    對于上述問題，美國NanoView公司所開發的全自動病毒熒光檢測分析系統是一款無需純化的、全自動的可對病毒進行表征分析的全新設備。該設備能夠提供全方位的病毒表征信息，包括病毒粒徑、病毒表面和內部病毒蛋白、病毒物理滴度、空載比檢測、病毒轉導效率及假型定量表征等。操作簡單，結果可靠。

    全自動病毒熒光檢測分析系統的基本原理是一種基于特異性免疫捕獲技術，允許研究者直接分析特定群體的病毒。通過配套的試劑盒，客戶一次性能夠分析多達16個不同的樣本，大大節省了時間和經濟成本。

    和傳統的病毒表征手段相比，全自動病毒熒光檢測分析系統有如下優勢：

• 無需純化

    NanoView的LentiView™技術可以對慢病毒進行檢測，將蛋白質組信息與物理病毒滴度結合起來，無需樣品純化。只需 35 µl 未純化或純化的樣品，檢測濃度低至106VP/ml。無需擔心純化帶來的誤差，更精確地測量樣品間的表征和表達信息的差異。

慢病毒示意圖

• 全方位的病毒粒徑分析

全自動外泌體熒光檢測分析系統能夠對>20 nm的病毒進行全方面的表征，無論是粒徑分布、空載病毒與完整病毒的假型分析均可在一次測試中得到。并且所用來測試的樣本無需進行純化，避免因純化帶來的樣本偏差。

• 病毒滴度

病毒物理滴度的最常用檢測方法是p24 ELISA。該方法測量p24衣殼蛋白的濃度并將其轉化為病毒物理滴度。樣品中溶解的p24、不同病毒p24含量的不同以及病毒聚集會影響檢測準確性。此外， p24 ELISA無法檢測缺少衣殼(空載)的顆粒。LentiView™可對樣品中病毒進行高靈敏度的定量檢測，獲得滴度數據，區分完整和空載病毒并識別樣品中雜質如可能經過純化帶有的外泌體等。

    紅色熒光抗體標記病毒的內部p24衣殼蛋白，用藍色熒光抗體標記VSV-G，同時表達p24和VSV-G的病毒顯示粉紅色，并由 NanoView專用軟件計數。

• 完整/空載病毒顆粒的比例

    NanoView的LentiView™技術可以簡單快速地分析出完整/空載病毒顆粒的比例，區分完整(成功轉導)和空載病毒并識別樣品中雜質，而完整/空載病毒顆粒的比例是確定轉導效率的主要依據。

    完整病毒是表達VSV-G和/或ETL，且表達衣殼蛋白p24的病毒顆粒，空載病毒是表達VSV-G和/或ETL，未表達衣殼蛋白p24的病毒顆粒

    LentiView™芯片表面固定的抗VSV-G抗體捕獲病毒后，即可檢測表面和內部蛋白標記物。在LentiView™獲得熒光圖像中，綠色熒光點代表沒有衣殼的VSV-G+病毒顆粒，黃色熒光點代表含有衣殼的完整病毒顆粒。

• 病毒轉導效率

    我們使用LentiView™對三種不同的慢病毒樣品進行了表征，檢測病毒顆粒亞群，進而研究這些載體的轉導效率。三種不同的慢病毒樣品分別為野生型慢病毒 (VSV wt)、含高濃度質粒的工程化靶向配體 (ETL-HC)、含低濃度質粒的工程化靶向配體 (ETL-LC)。

三種慢病毒載體的轉導效率

轉導效率與物理滴度的對比

    根據病毒碎片粒徑和病毒粒徑的差別，對每一種載體中的病毒和病毒碎片數量進行統計。50nm以上的病毒與50nm以下的病毒碎片的比例和載體的轉導效率之間存在很強的相關性。

載體轉導效率和病毒與病毒碎片比例的對比

• 完全定制化

    客戶通過ViroFlex技術使用連接蛋白連接任意定制化的捕獲抗體，并結合到ViroFlex芯片表面進而捕獲所需的病毒，在自己的實驗室里輕松進行高度定制化的檢測。

ViroFlex的芯片捕獲抗體排布示意圖

ViroFlex定制化檢測原理：

• 先將連接蛋白與所需的定制抗體連接

• 再將連接抗體的連接蛋白與ViroFlex芯片表面的連接蛋白抗體連接

• 所需的定制抗體從而結合到了芯片上

• 將樣品在芯片上孵育，定制抗體即可特異性捕獲病毒

• 每個芯片最多可結合兩種定制化捕獲抗體

ViroFlex芯片的捕獲原理(左)與普通芯片的捕獲原理(右)示意圖

ExoViewTM參數信息：

• 顆粒大小分辨范圍：20nm

• 最低檢測濃度為106 VP/mL

• 所需樣本體積：35 μL

• 激發波長：410 nm，488 nm，555 nm，640 nm，750nm

• 可一次檢測16個樣本，每個樣本可同時檢測6個不同亞型及4種生物標記的熒光定位

• 捕獲抗體：一個芯片最多允許6種捕獲抗體（+陰性對照）

• 熒光通道：4個熒光通道

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