10x Genomics 的Visium FFPE 空間轉錄組自2021年5月推出以來，很多研究FFPE樣本的科學家踴躍開展實驗，這不到一年的時間，全球首篇FFPE空間轉錄組的文章就發表啦，真是可喜可賀！今天，小編就為您分享一下這篇大作！

文章題目：Tertiary lymphoid structures generate and propagate anti-tumor antibody-producing plasma cells in renal cell cancer

發表時間：2022年3月

發表期刊：Immunity

影響因子：31.428

發表單位：法國索邦大學Cordeliers研究院

自身免疫性疾病、慢性感染、移植物排斥和癌癥中長期炎癥和抗原持久性的組織中存在三級淋巴結構（TLS）。腫瘤內的TLS與愈后是否良好相關。TLS是在成纖維細胞網絡上形成的淋巴聚集體，包括一個T細胞區，以及一個B細胞區。成熟的TLS存在一個中心（GC），其中包含T濾泡輔助（Tfh）細胞和與B細胞密切接觸的濾泡樹突狀細胞。一些研究表明，含GC的成熟TLS，與臨床預后有關。這在肝細胞癌、肺鱗狀細胞癌、結直腸癌和胰癌中都有驗證。本研究針對ccRCC原發性腫瘤，作者做了12個冷凍切片空間轉錄組和12個FFPE切片空間轉錄組并結合BCR分析、多色免疫熒光等分析，發現腫瘤中的三級淋巴結構產生成熟B細胞，血漿細胞擴散到腫瘤基部中，產生抗體與腫瘤細胞結合并引發其凋亡。

研究結果

1.空間腫瘤微環境揭示了TLS⁺腫瘤中富含B細胞的相關區域

為了分析TLS對腫瘤微環境影響，作者使用了來自10x的Visium空間轉錄組學技術。本研究對12個冰凍和12個石蠟包埋的 ccRCC原發性腫瘤切片進行了空間轉錄組檢測。在對切片進行H&E染色后，病理學家注釋了每個腫瘤組織以及TLS的定位。

下圖展示的是一個TLS Positive冷凍腫瘤、一個TLS Positive FFPE腫瘤和一個TLS negative冷凍腫瘤。碳酸酐酶9（蛋白質名稱：CAIX，基因名稱：Ca9）是ccRCC腫瘤細胞的標志物，在腫瘤切片中均勻分布。如下圖所示，TLS+腫瘤中，B細胞譜系和T細胞基因在TLS區域內優先表達。與腫瘤組織的其他部分相比，TLS區域的B譜系和T細胞評分分布更高。TLS的單核細胞譜系略高，而NK細胞在整個腫瘤切片中分布更廣。內皮細胞和中性粒細胞分布均勻，而纖維細胞在TLS區域的高表達。TLS與B譜系、T細胞和成纖維細胞特征的表達有關。

圖1 腫瘤微環境中免疫細胞和基質細胞群的空間轉錄組學結果

2.TLS內部和外部的免疫球蛋白（Ig）基因表達

為了確定TLS在腫瘤中的轉錄情況，在根據HE的結果定義TLS后，作者在TLS腫瘤區域之間進行了差異基因表達分析。在與Ig基因（IGKC、JCHAIN）、IGG1和IGHA1基因相同的位置發現了成纖維細胞標志物COL1A1的高表達。作者分析了CXCL12的表達。總體而言，作者總結了在TLS+腫瘤中，表達PC的IGG1和IGHA1預先轉移到TLS附近，并可能與成纖維細胞一起在腫瘤內傳播。

3.空間B細胞受體（BCR）分析可識別原位超突變和克隆選擇

TLS中B細胞成熟亞型和PC的共定位暗示了原位B細胞適應免疫而產生。在這種過程中，B細胞發生了突變細胞受體序列，并選擇和擴展大多數克隆。

作者研究BCR的核苷酸序列。因為Visium冰凍切片空間技術是基于Bracode的RNA測序，這使作者能夠查詢原始轉錄物并進行空間BCR分析。作者使用MiXCR工具從Bulk水平5’RNA測序和3’ FF Visium 數據中識別BCR IgL和IgH克隆型及其種系超突變，捕獲大多數IGL和一些IGH序列的完整CDR3區域。

圖2 空間BCR剖析識別腫瘤區突變和克隆擴增和傳播

研究發現，在TLS外的區域，大多是高度突變序列。盡管如此，在TLS內區域測量了包括高度突變序列在內的所有突變，而TLS外區域的大多數Ig轉錄物都富含高度突變序列，這表明細胞超突變發生在TLS中，并表明突變PC在整個腫瘤中傳播。

作者檢查了47個ccRCC腫瘤（包括由Visium的12個冷凍腫瘤）中bulk水平5’RNA序列的輕鏈和重鏈突變。為了確定細胞超突變是否伴有克隆型選擇，作者研究了大量bulk 水平5’ RNA-seq數據的IgH。高TLS的樣本表現出高總克隆數，同時超過100倍的克隆類型數比例更高。

最后，為了確定擴增IgH克隆型的克隆關系和位置，作者對30個RNA-seq空間數據進行了克隆性評估。作者證明了相應的B細胞克隆的遷移。在TLS低樣本中，檢測到的克隆類型數量非常低，這也支持了腫瘤內PC主要在TLS中生成的命題。

圖3 PC與成纖維細胞和IgG腫瘤染色在TLS+腫瘤中的共定位

總而言之，這些數據支持原位TLS介導的成熟發育、選擇、克隆擴增過程，并且在腫瘤的各個區域傳播PC細胞。

4.血漿細胞沿著成纖維細胞軌跡從TLS傳播

為了分析腫瘤內PC和成纖維細胞的位置以及CXCL12的原位表達，作者使用了FFPE腫瘤切片多色熒光標記，多發性骨髓瘤癌基因1（MUM1）（IRF4）作為PC的特定標記， COL1（Col1a）作為成纖維的特定標記。

這些數據概括了Ig和成纖維細胞轉錄物的共同表達，以及成纖維細胞轉錄物和CXCL12的共同表達，并驗證了PC在TLS內和空間轉錄組學確定的成纖維細胞網狀細胞軌跡中的位置。

5.TLS和Ig產生PC與凋亡腫瘤細胞結合的IgG抗體有關，并對免疫治療有反應

為了進一步研究TLS、腫瘤內PC和Ig的聯系，作者首先分析了TLS的成熟度。成熟的TLS特征是GC包含B細胞區，周圍是T細胞區，其中CD4+PD1+ T細胞、CD4+ PD1+CXCR5+ Tfh細胞和產生CXCL13的細胞被檢測到（如下圖）。

圖4 成熟的TLS+腫瘤顯示有更多的MUM1+ PC

作者進一步研究了TLS成熟度標記與57個TLS+樣品上MUM1+IgG+和MUM1+IgA+ PC密度的相關性。作者發現TLS具有CD23+ FDC、BCL6+細胞和PNAd+ HEV與MUM1+IgG+ PC和MUM1+IgA+ PC密度之間存在很強的相關性。結合抗人類IgG在TLS+腫瘤中被觀察到，而在TLS腫瘤中沒有觀察到。對103個腫瘤的量化顯示，IgG陽性率很高，與TLS腫瘤相比，TLS+的腫瘤細胞高達100%。在TLS+和TLS中都觀察到弱IgA（如下圖）。

圖5 與未成熟或沒有TLS的腫瘤相比，有TLS腫瘤的IgG+

CAIX+腫瘤細胞增加。這與腫瘤細胞死亡和對ICI的反應有關

為了揭示腫瘤結合的IgG抗體的潛在功能，作者調查了腫瘤細胞中發生凋亡的跡象，凋亡細胞數量高，IgG腫瘤細胞比例很高。

為了評估IgG腫瘤對ICI治療患者的影響，作者評估了患者的35個NI治療的腫瘤患者和16個Nivolumab治療的腫瘤患者。與低IgG腫瘤細胞患者相比，高IgG腫瘤細胞患者的PFS要長得多。 

總結

腫瘤的三級淋巴結構（TLS）會影響癌癥免疫治療的效果。作者使用空間轉錄組學來說明腎細胞癌（RCC）TLS中B細胞的反應。B細胞在TLS中富集，Visium可以識別B細胞向血漿細胞（PC）轉化過程中的所有階段。分析B細胞揭示TLS中的克隆多樣化、選擇、擴增等過程，并且發現遠端存在完全成熟的克隆類型。

在TLS+腫瘤中，產生IgG和IgA的PC沿著成纖維細胞軌跡傳播到腫瘤基部。TLS+腫瘤中產生了較多的IgG轉化來的PC、IgG以及凋亡惡性細胞，這表明抗腫瘤效應的活性。免疫治療反應相關的B細胞成熟和抗體產生的過程發生在腫瘤中的TLS，TLS可能具有抗腫瘤作用。這為腫瘤治療提供了全新的思路。