一、背景

　　人肝癌細胞來源于一名15歲的白人少年的肝癌組織。該細胞表達甲胎蛋白、白蛋白、α-2-巨球蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、轉鐵蛋白、α-1-抗凝乳蛋白酶、結合珠蛋白、銅藍蛋白、纖溶酶原、補體C4、C3激活物、纖維蛋白原、α-1酸性糖蛋白、α-2-HS-糖蛋白、β-脂蛋白、視黃醇結合蛋白；表達胰島素受體和胰島素樣生長因子IGFⅡ的受體；該細胞具有3-羥基-3-甲酰輔酶A還原酶和肝甘油三酯脂肪酶的活性。目前尚未證明該細胞中有HBV基因組。

　　二、細胞培養方法

　　1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

　　①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

　　②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養箱消化；

　　③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入完全培養基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養箱繼續消化至可以輕輕吹打下為止；

　　④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

　　⑤用新鮮培養基重懸后加入培養瓶或皿中，T25培養瓶加6-8ml培養基；

　　⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養瓶中。

　　2、細胞復蘇：

　　①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養基混勻。

　　②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養基吹勻，將細胞懸液加入培養瓶中，補加適量培養基。

　　3、細胞凍存：待細胞生長狀態良好時進行細胞凍存保種

　　①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL0.25%胰蛋白酶（T25瓶）

　　②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入完全培養基終止消化；

　　③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

　　④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

　　三、應用

　　用于蜂毒素誘導保護性自噬對人肝癌細胞生長的影響研究：

　　以人肝癌細胞SMMC-7721、HepG2為研究對象,并建立了肝癌細胞荷瘤鼠模型,在體、內外研究蜂毒素對人肝癌細胞自噬的誘導作用,并分別通過激活和抑制自噬觀察蜂毒素對人肝癌細胞增殖、凋亡、細胞死亡的作用,明確自噬在蜂毒素誘導人肝癌細胞死亡中的作用和地位。通過對自噬、凋亡相關通路蛋白的檢測,探討蜂毒素誘導人肝癌細胞死亡可能的相關作用機制,為以后蜂毒素的抗腫瘤研究提供實驗基礎和思路。

　　蜂毒素對人肝癌細胞增殖抑制及誘導自噬作用：

　　1、MTT法檢測不同濃度Mel對人肝癌HepG2、SMMC-7721細胞分別作用不同時間的增殖抑制率;通過倒置相差顯微鏡觀察不同濃度Mel作用人肝癌HepG2、SMMC-7721細胞24h細胞形態變化;通過AnnexinV-FIFC/PI雙染法檢測不同濃度Mel作用人肝癌HepG2、SMMC-7721細胞24h細胞凋亡情況;通過臺盼藍染色法檢測檢測不同濃度Mel作用人肝癌HepG2、SMMC-7721細胞24h細胞的死亡情況。

　　2、WesternBlot分別檢測不同濃度Mel作用人肝癌HepG2、SMMC-7721細胞24h及5μg/mLMel作用人肝癌HepG2、SMMC-7721細胞不同時間后,LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin1、p62蛋白的表達;透射電鏡檢測5μg/mLMel作用人肝癌HepG2細胞不同時間（0h、24h）后細胞自噬體的形成情況;免疫熒光檢測5μg/mLMel對人肝癌HepG2細胞干預24h后Beclin1的表達;對人肝癌HepG2細胞進行pEGFP-LC3質粒轉染,激光共聚焦檢測Mel對人肝癌HepG2細胞LC3的表達。

　　自噬機制在蜂毒素誘導人肝癌細胞死亡中的作用：

　　1、MTT法、AnnexinV-FIFC/PI雙染法、臺盼藍染色法檢測自噬抑制劑、自噬激活劑單獨和聯合5μg/mLMel對人肝癌HepG2、SMMC-7721細胞分別作用24h后的增殖抑制率、細胞凋亡及細胞死亡情況。

　　2、自噬抑制劑單獨和聯合5μg/mLMel對人肝癌HepG2、SMMC-7721細胞干預后,WesternBlot檢測Beclin1復合物及凋亡通路相關蛋白的表達情況。