細(xì)胞培養(yǎng)的注意事項(xiàng)及常見問題與解答
一、無菌操作
細(xì)胞培養(yǎng)最看重的就是無菌操作，無菌操作是細(xì)胞培養(yǎng)是否成功的關(guān)鍵點(diǎn)。
1、使用前用75%的乙醇擦拭細(xì)胞間的桌面、超凈臺(tái)、孵箱和離心機(jī)等；紫外照射細(xì)胞間和超凈臺(tái)30分鐘以上才可以進(jìn)入使用。
2、進(jìn)入細(xì)胞間必須穿上隔離服或者細(xì)胞間專用的白大衣，戴上手套和口罩，換上拖鞋，嚴(yán)格意義上來說，帽子也是要帶的。除了隔離服，其他穿著物品最好一次性使用。
3、凡是放入超凈臺(tái)中的不是一次性使用的物品事先都需要經(jīng)過高壓滅菌；不能進(jìn)行高壓處理的物品也需要經(jīng)過75%的乙醇消毒。包括酒精燈、吸管、移液器、試管架、培養(yǎng)皿、廢液缸等。
4、操作過程中盡量接近酒精燈；用鑷子拿取槍頭、離心管、吸管等物品時(shí)，避免碰到使用端；不要在開口器皿的上端進(jìn)行操作。
5、細(xì)胞間的設(shè)計(jì)都是一層層的隔間，每一層隔間的拉門都必須關(guān)好；當(dāng)有人在超凈臺(tái)工作時(shí)，其他人員不允許進(jìn)入操作區(qū)域。
二、培養(yǎng)基
1、培養(yǎng)基的選擇依細(xì)胞種類而定。如果是從別的實(shí)驗(yàn)室借來的細(xì)胞，最初階段一定要保持細(xì)胞原有的培養(yǎng)條件；特殊種類的細(xì)胞，比如內(nèi)皮細(xì)胞，可以借鑒網(wǎng)上培養(yǎng)成功的條件，添加一些特定成分。
2、液體培養(yǎng)基的保存條件應(yīng)是冰箱4度冷藏。小六兒見過有的大實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞量多，一次性購買的培養(yǎng)基瓶數(shù)也多，有些人可能覺得-20冰箱保存時(shí)間會(huì)更久一些。但是經(jīng)過冷凍后的培養(yǎng)基再溶化時(shí)，你會(huì)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的顏色發(fā)生變化，顏色變深，這就是培養(yǎng)基的PH值升高了。
3、培養(yǎng)基中都含有大量的谷氨酰胺，用來合成細(xì)胞生長所需要的核酸和蛋白質(zhì)。但是谷氨酰胺在溶液中不穩(wěn)定，保存4周后的培養(yǎng)基需要重新加入谷氨酰胺。所以盡量不要大批量購買培養(yǎng)，也不要一次配太多的培養(yǎng)基。
4、細(xì)胞適合的培養(yǎng)基PH值是7.2-7.4，偏高或偏低都不好，但相對(duì)于堿性條件而言，細(xì)胞更耐酸。原代細(xì)胞對(duì)PH值的變化很敏感，而永生性細(xì)胞相對(duì)來說忍受力更強(qiáng)一些。
5、造成皿或瓶內(nèi)培養(yǎng)基PH值變化的原因有很多：細(xì)胞增殖速度的快慢、孵箱內(nèi)二氧化碳的濃度不準(zhǔn)確、培養(yǎng)瓶的蓋子擰緊或者發(fā)生了污染。如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長過慢，刨除細(xì)胞本身狀態(tài)的原因，可以在培養(yǎng)液中添加丙酮酸鈉（丙酮酸鈉是糖酵解的中間產(chǎn)物，為細(xì)胞生長提供ATP，提供合成大代謝所需要的碳源，使用濃度通常是0.1mM）。
6、細(xì)胞發(fā)生污染，培養(yǎng)基的PH值也會(huì)發(fā)生變化。如果新配置的培養(yǎng)基出現(xiàn)沉淀，很可能是廣口瓶沒有清洗干凈，瓶中殘留的磷酸鹽造成培養(yǎng)基成分的析出。
7、孵箱內(nèi)濕度對(duì)維持培養(yǎng)基的滲透壓也有很重要的作用。大部分細(xì)胞適應(yīng)的滲透壓在260-320mOsm/kg。濕度不夠時(shí)，培養(yǎng)基蒸發(fā)，液體的滲透壓就會(huì)升高。
8、培養(yǎng)基在使用前需提前從冰箱拿出，使其恢復(fù)至室溫或者37度水浴。
9、操作過程中，如果槍頭中已經(jīng)有培養(yǎng)基或其他液體成分，不要再經(jīng)過酒精燈被高溫加熱。高溫不僅會(huì)使有效成分失效，更有可能產(chǎn)生有毒物質(zhì)。
10、我們購買的培養(yǎng)基瓶上都會(huì)標(biāo)注避光保存，這是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的某些成分遇光會(huì)產(chǎn)生過氧化氫，具有細(xì)胞毒性。我們?cè)诔瑑襞_(tái)中處理細(xì)胞時(shí)，因?yàn)闀r(shí)間較短，不會(huì)產(chǎn)生太大問題。但是如果長時(shí)間放置在室外或燈光下照射，或者有的冷藏冰柜的門是玻璃的，就會(huì)造成培養(yǎng)基質(zhì)量的下降。
三、血清
1、血清分為：
a)新生牛血清（新生的小牛5天內(nèi)取血）；
b)小牛血清（16周內(nèi)的小牛取血）；
c)胎牛血清（剖腹取出胎兒制成的）。
2、我們買來的血清多處于冰凍狀態(tài)，滅活前放到4度冰箱，使其緩慢溶化。56度水浴45分鐘滅活，滅活后冷卻至室溫再放回冰箱冷凍層中。滅活是滅活補(bǔ)體系統(tǒng)中具有蛋白酶活性的成分，對(duì)于一些難養(yǎng)的細(xì)胞，滅活補(bǔ)體是很重要的。但是滅活的溫度也可能會(huì)破壞血清中的生長因子，所以到底該不該滅活血清，還沒有一個(gè)很明確的標(biāo)準(zhǔn)，可能還是要視情況而定吧。
3、血清在溶化過程中，纖維蛋白原會(huì)轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，所以有時(shí)我們會(huì)看到絮狀物，但是這種情況是不影響血清的質(zhì)量的。
四、傳代
1、貼壁細(xì)胞傳代時(shí)，先用消化液潤洗一遍；棄掉后，再加入適量消化液置于孵箱或鏡下觀察消化；當(dāng)細(xì)胞變圓，彼此之間產(chǎn)生空隙，加入等量或大量的培養(yǎng)基終止消化，培養(yǎng)基中的血清可以抑制胰蛋白酶的活性。
2、這里我沒有明確提到胰蛋白酶的濃度，并不是說濃度越高越好。胰蛋白酶底物的特異性差，會(huì)破壞細(xì)胞膜成分。PH8.0，37度環(huán)境下，消化液的消化能力是最強(qiáng)的。培養(yǎng)基中的血清會(huì)降低胰酶的消化能力，所以每次消化前，也要用PBS反復(fù)沖洗干凈培養(yǎng)皿。日常用的比較多的消化液濃度：
a)0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA
b)0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA
c)0.25%胰蛋白酶
3、傳代后如果細(xì)胞不貼壁，可能的原因是胰蛋白酶消化過度或者沒有清洗干凈EDTA。
4、懸浮細(xì)胞傳代時(shí)，正常收集細(xì)胞、離心濃縮、用培養(yǎng)基重懸就可以了。懸浮細(xì)胞每次換液都需要離心重懸，但是由于懸浮細(xì)胞一般會(huì)處于單細(xì)胞層生長，有的時(shí)候生長速度很快，重懸后如果不晃動(dòng)培養(yǎng)皿，就會(huì)看到細(xì)胞成團(tuán)；如果經(jīng)常顯示懸浮細(xì)胞大量抱團(tuán)生長，也有可能是培養(yǎng)基中的血清問題、或者鈣鎂離子濃度的變化造成了細(xì)胞間的粘附力改變。
五、細(xì)胞死亡及生長異常
1、首先講一下細(xì)胞生長緩慢的原因：
a)更換了血清或者培養(yǎng)基，細(xì)胞需要一段時(shí)間適應(yīng)一下；
b)由于細(xì)胞的特殊種類，培養(yǎng)基中缺少某些生長因子；
c)培養(yǎng)基中有少量真菌或者細(xì)菌污染；
d)傳代的時(shí)候細(xì)胞密度過低；
e)細(xì)胞狀態(tài)老化；
f)支原體污染。
2、解決上述問題的方法：
a)如果實(shí)驗(yàn)室沒有某種細(xì)胞最適宜的培養(yǎng)基，可以先用原培養(yǎng)條件凍存一些，然后逐漸增加新的培養(yǎng)基比例，25%、50%、75%到100%，傳代3-5次后，讓細(xì)胞慢慢適應(yīng)。
b)判斷是不是培養(yǎng)基發(fā)生污染，可以先不加抗生素，觀察細(xì)胞狀態(tài)。
c)增加細(xì)胞的接種密度。
d)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞老化的時(shí)候，及時(shí)更換新的細(xì)胞。
e)如果懷疑是支原體污染，一定要隔離疑似污染的培養(yǎng)皿，及時(shí)清潔消毒孵箱。
3、造成細(xì)胞死亡的原因：
a)細(xì)胞消化過度；
b)沒有及時(shí)換液，營養(yǎng)成分消耗殆盡；
c)如果前一天細(xì)胞的狀態(tài)很好，換液之后就全死了，應(yīng)該考慮是否是培養(yǎng)基或者血清的問題。
4、如何判定細(xì)胞是否發(fā)生支原體污染：可以選用直接培養(yǎng)法、熒光染色或PCR方法檢測，比較常用的是PCR。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生支原體污染時(shí)，原則上是能夠去除支原體的，但是整個(gè)過程耗時(shí)耗力，還要考驗(yàn)個(gè)人操作能力。所以如果不是處于細(xì)胞存量很少的情況下，建議發(fā)現(xiàn)污染時(shí)立刻棄掉，重新培養(yǎng)。
5、如果孵箱中只是某種細(xì)胞持續(xù)性大量死亡，而其他細(xì)胞狀態(tài)都沒問題的話，基本上可以確定就是孵箱存在特異性感染這類細(xì)胞的真菌或細(xì)菌，遇到這種情況，小六兒也不知道該怎么做，只能是先停一段時(shí)間看看。。。。。。
6、其他注意事項(xiàng)：每個(gè)星期都要更換孵箱底盤中的水（紫外照射后超純水）；每兩周消毒一次孵箱：75%酒精擦拭一遍后，再用0.1%新潔爾滅擦拭一遍（都用超純水配制）；可以在孵箱底部放一個(gè)燒杯，里面放入飽和硫酸銅，可以抑制霉菌生長。不過也有人說硫酸銅會(huì)改變孵箱的PH值，如果不是孵箱污染的情況很嚴(yán)重，建議不要使用。
細(xì)胞培養(yǎng)最看重的就是無菌操作，無菌操作是細(xì)胞培養(yǎng)是否成功的關(guān)鍵點(diǎn)。
1、使用前用75%的乙醇擦拭細(xì)胞間的桌面、超凈臺(tái)、孵箱和離心機(jī)等；紫外照射細(xì)胞間和超凈臺(tái)30分鐘以上才可以進(jìn)入使用。
2、進(jìn)入細(xì)胞間必須穿上隔離服或者細(xì)胞間專用的白大衣，戴上手套和口罩，換上拖鞋，嚴(yán)格意義上來說，帽子也是要帶的。除了隔離服，其他穿著物品最好一次性使用。
3、凡是放入超凈臺(tái)中的不是一次性使用的物品事先都需要經(jīng)過高壓滅菌；不能進(jìn)行高壓處理的物品也需要經(jīng)過75%的乙醇消毒。包括酒精燈、吸管、移液器、試管架、培養(yǎng)皿、廢液缸等。
4、操作過程中盡量接近酒精燈；用鑷子拿取槍頭、離心管、吸管等物品時(shí)，避免碰到使用端；不要在開口器皿的上端進(jìn)行操作。
5、細(xì)胞間的設(shè)計(jì)都是一層層的隔間，每一層隔間的拉門都必須關(guān)好；當(dāng)有人在超凈臺(tái)工作時(shí)，其他人員不允許進(jìn)入操作區(qū)域。
二、培養(yǎng)基
1、培養(yǎng)基的選擇依細(xì)胞種類而定。如果是從別的實(shí)驗(yàn)室借來的細(xì)胞，最初階段一定要保持細(xì)胞原有的培養(yǎng)條件；特殊種類的細(xì)胞，比如內(nèi)皮細(xì)胞，可以借鑒網(wǎng)上培養(yǎng)成功的條件，添加一些特定成分。
2、液體培養(yǎng)基的保存條件應(yīng)是冰箱4度冷藏。小六兒見過有的大實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞量多，一次性購買的培養(yǎng)基瓶數(shù)也多，有些人可能覺得-20冰箱保存時(shí)間會(huì)更久一些。但是經(jīng)過冷凍后的培養(yǎng)基再溶化時(shí)，你會(huì)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的顏色發(fā)生變化，顏色變深，這就是培養(yǎng)基的PH值升高了。
3、培養(yǎng)基中都含有大量的谷氨酰胺，用來合成細(xì)胞生長所需要的核酸和蛋白質(zhì)。但是谷氨酰胺在溶液中不穩(wěn)定，保存4周后的培養(yǎng)基需要重新加入谷氨酰胺。所以盡量不要大批量購買培養(yǎng)，也不要一次配太多的培養(yǎng)基。
4、細(xì)胞適合的培養(yǎng)基PH值是7.2-7.4，偏高或偏低都不好，但相對(duì)于堿性條件而言，細(xì)胞更耐酸。原代細(xì)胞對(duì)PH值的變化很敏感，而永生性細(xì)胞相對(duì)來說忍受力更強(qiáng)一些。
5、造成皿或瓶內(nèi)培養(yǎng)基PH值變化的原因有很多：細(xì)胞增殖速度的快慢、孵箱內(nèi)二氧化碳的濃度不準(zhǔn)確、培養(yǎng)瓶的蓋子擰緊或者發(fā)生了污染。如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長過慢，刨除細(xì)胞本身狀態(tài)的原因，可以在培養(yǎng)液中添加丙酮酸鈉（丙酮酸鈉是糖酵解的中間產(chǎn)物，為細(xì)胞生長提供ATP，提供合成大代謝所需要的碳源，使用濃度通常是0.1mM）。
6、細(xì)胞發(fā)生污染，培養(yǎng)基的PH值也會(huì)發(fā)生變化。如果新配置的培養(yǎng)基出現(xiàn)沉淀，很可能是廣口瓶沒有清洗干凈，瓶中殘留的磷酸鹽造成培養(yǎng)基成分的析出。
7、孵箱內(nèi)濕度對(duì)維持培養(yǎng)基的滲透壓也有很重要的作用。大部分細(xì)胞適應(yīng)的滲透壓在260-320mOsm/kg。濕度不夠時(shí)，培養(yǎng)基蒸發(fā)，液體的滲透壓就會(huì)升高。
8、培養(yǎng)基在使用前需提前從冰箱拿出，使其恢復(fù)至室溫或者37度水浴。
9、操作過程中，如果槍頭中已經(jīng)有培養(yǎng)基或其他液體成分，不要再經(jīng)過酒精燈被高溫加熱。高溫不僅會(huì)使有效成分失效，更有可能產(chǎn)生有毒物質(zhì)。
10、我們購買的培養(yǎng)基瓶上都會(huì)標(biāo)注避光保存，這是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的某些成分遇光會(huì)產(chǎn)生過氧化氫，具有細(xì)胞毒性。我們?cè)诔瑑襞_(tái)中處理細(xì)胞時(shí)，因?yàn)闀r(shí)間較短，不會(huì)產(chǎn)生太大問題。但是如果長時(shí)間放置在室外或燈光下照射，或者有的冷藏冰柜的門是玻璃的，就會(huì)造成培養(yǎng)基質(zhì)量的下降。
三、血清
1、血清分為：
a)新生牛血清（新生的小牛5天內(nèi)取血）；
b)小牛血清（16周內(nèi)的小牛取血）；
c)胎牛血清（剖腹取出胎兒制成的）。
2、我們買來的血清多處于冰凍狀態(tài)，滅活前放到4度冰箱，使其緩慢溶化。56度水浴45分鐘滅活，滅活后冷卻至室溫再放回冰箱冷凍層中。滅活是滅活補(bǔ)體系統(tǒng)中具有蛋白酶活性的成分，對(duì)于一些難養(yǎng)的細(xì)胞，滅活補(bǔ)體是很重要的。但是滅活的溫度也可能會(huì)破壞血清中的生長因子，所以到底該不該滅活血清，還沒有一個(gè)很明確的標(biāo)準(zhǔn)，可能還是要視情況而定吧。
3、血清在溶化過程中，纖維蛋白原會(huì)轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，所以有時(shí)我們會(huì)看到絮狀物，但是這種情況是不影響血清的質(zhì)量的。
四、傳代
1、貼壁細(xì)胞傳代時(shí)，先用消化液潤洗一遍；棄掉后，再加入適量消化液置于孵箱或鏡下觀察消化；當(dāng)細(xì)胞變圓，彼此之間產(chǎn)生空隙，加入等量或大量的培養(yǎng)基終止消化，培養(yǎng)基中的血清可以抑制胰蛋白酶的活性。
2、這里我沒有明確提到胰蛋白酶的濃度，并不是說濃度越高越好。胰蛋白酶底物的特異性差，會(huì)破壞細(xì)胞膜成分。PH8.0，37度環(huán)境下，消化液的消化能力是最強(qiáng)的。培養(yǎng)基中的血清會(huì)降低胰酶的消化能力，所以每次消化前，也要用PBS反復(fù)沖洗干凈培養(yǎng)皿。日常用的比較多的消化液濃度：
a)0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA
b)0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA
c)0.25%胰蛋白酶
3、傳代后如果細(xì)胞不貼壁，可能的原因是胰蛋白酶消化過度或者沒有清洗干凈EDTA。
4、懸浮細(xì)胞傳代時(shí)，正常收集細(xì)胞、離心濃縮、用培養(yǎng)基重懸就可以了。懸浮細(xì)胞每次換液都需要離心重懸，但是由于懸浮細(xì)胞一般會(huì)處于單細(xì)胞層生長，有的時(shí)候生長速度很快，重懸后如果不晃動(dòng)培養(yǎng)皿，就會(huì)看到細(xì)胞成團(tuán)；如果經(jīng)常顯示懸浮細(xì)胞大量抱團(tuán)生長，也有可能是培養(yǎng)基中的血清問題、或者鈣鎂離子濃度的變化造成了細(xì)胞間的粘附力改變。
五、細(xì)胞死亡及生長異常
1、首先講一下細(xì)胞生長緩慢的原因：
a)更換了血清或者培養(yǎng)基，細(xì)胞需要一段時(shí)間適應(yīng)一下；
b)由于細(xì)胞的特殊種類，培養(yǎng)基中缺少某些生長因子；
c)培養(yǎng)基中有少量真菌或者細(xì)菌污染；
d)傳代的時(shí)候細(xì)胞密度過低；
e)細(xì)胞狀態(tài)老化；
f)支原體污染。
2、解決上述問題的方法：
a)如果實(shí)驗(yàn)室沒有某種細(xì)胞最適宜的培養(yǎng)基，可以先用原培養(yǎng)條件凍存一些，然后逐漸增加新的培養(yǎng)基比例，25%、50%、75%到100%，傳代3-5次后，讓細(xì)胞慢慢適應(yīng)。
b)判斷是不是培養(yǎng)基發(fā)生污染，可以先不加抗生素，觀察細(xì)胞狀態(tài)。
c)增加細(xì)胞的接種密度。
d)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞老化的時(shí)候，及時(shí)更換新的細(xì)胞。
e)如果懷疑是支原體污染，一定要隔離疑似污染的培養(yǎng)皿，及時(shí)清潔消毒孵箱。
3、造成細(xì)胞死亡的原因：
a)細(xì)胞消化過度；
b)沒有及時(shí)換液，營養(yǎng)成分消耗殆盡；
c)如果前一天細(xì)胞的狀態(tài)很好，換液之后就全死了，應(yīng)該考慮是否是培養(yǎng)基或者血清的問題。
4、如何判定細(xì)胞是否發(fā)生支原體污染：可以選用直接培養(yǎng)法、熒光染色或PCR方法檢測，比較常用的是PCR。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生支原體污染時(shí)，原則上是能夠去除支原體的，但是整個(gè)過程耗時(shí)耗力，還要考驗(yàn)個(gè)人操作能力。所以如果不是處于細(xì)胞存量很少的情況下，建議發(fā)現(xiàn)污染時(shí)立刻棄掉，重新培養(yǎng)。
5、如果孵箱中只是某種細(xì)胞持續(xù)性大量死亡，而其他細(xì)胞狀態(tài)都沒問題的話，基本上可以確定就是孵箱存在特異性感染這類細(xì)胞的真菌或細(xì)菌，遇到這種情況，小六兒也不知道該怎么做，只能是先停一段時(shí)間看看。。。。。。
6、其他注意事項(xiàng)：每個(gè)星期都要更換孵箱底盤中的水（紫外照射后超純水）；每兩周消毒一次孵箱：75%酒精擦拭一遍后，再用0.1%新潔爾滅擦拭一遍（都用超純水配制）；可以在孵箱底部放一個(gè)燒杯，里面放入飽和硫酸銅，可以抑制霉菌生長。不過也有人說硫酸銅會(huì)改變孵箱的PH值，如果不是孵箱污染的情況很嚴(yán)重，建議不要使用。
標(biāo)簽：
細(xì)胞培養(yǎng)
- 細(xì)胞檢測試劑盒免費(fèi)送，反饋即享100%京東卡好禮！
- 2025動(dòng)物生物育種與繁殖技術(shù)學(xué)術(shù)交流研討會(huì)通知
- 開年上新：尚恩生物細(xì)胞轉(zhuǎn)染服務(wù)正式上線啦!
- 尚恩生物開年大促銷，福利疊滿解鎖新學(xué)期！
- 尚恩生物年終大促—4款細(xì)胞系套餐送500ml完全培養(yǎng)基
- 尚恩生物雙11促銷：任意細(xì)胞系+配套完培下單立減100
- 賽業(yè)今晚直播：點(diǎn)突變細(xì)胞株構(gòu)建策略及其研究應(yīng)用
- 賽業(yè)講座：兩步灌流法提取原代鼠肝臟Kupffer細(xì)胞
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com