原代細胞的培養步驟

一、靜置貼壁細胞(包括半貼壁細胞的培養)培養要求

1、細胞要通過充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性；

2、細胞接種時濃度要稍大一些，至少為5×108細胞/L；

3、培養基可用Eagle(MEM)或DNEM培養；

4、小牛血清濃度為10%-80%；

5、應在37℃5%CO2的培養箱中培養；

6、在起始的2天中盡量減少振蕩，以防止剛貼壁的細胞發生脫落，漂浮；

7、待細胞基本貼壁伸展并逐漸形成網狀，應將原代細胞換液；

8、用骨髓或外周血中的懸浮細胞經靜置培養1周時，應將細胞懸液經低速離心后換液。

二、懸浮細胞的培養要求

1、原代培養時要盡量去除紅細胞；

2、短期培養，可在含10%小牛血清的RPMI1640培養基中進行；

3、細胞濃度可在5-8×109/L范圍內進行分瓶試驗；

4、長期培養時，淋巴細胞中要加入生長因子，白血病細胞中要加入少量的原患者血清，以利細胞生長；

5、細胞換液一般每隔3天需半量換液一次；

6、細胞傳代一般待細胞增殖加快、細胞密度較高時才能進行。

三、原代細胞的維持

1、貼壁細胞長成網狀或基本單層時，未達到飽和密度，需采取換液方式來更新營養成分以滿足細胞繼續生長繁殖的需要；

2、換入等量完全培養基或換成含2%小牛血清的維持液；

3、懸浮細胞細胞培養基中不僅會發生轉化而且會發生分裂繁殖，此時培養基中的營養成分并不能維持細胞的營養需求，需進行換液。通常采用半量換液的方法；

四、原代細胞培養的首次傳代

原代培養后由于懸浮細胞增殖，數量增加甚至達飽和密度；貼壁細胞的相互匯合，使整個瓶底逐漸被細胞覆蓋，細胞難以繼續生長繁殖，需要進行分瓶培養，這種使原代細胞經分散接種的過程稱之為傳代。

首次傳代應注意以下幾點：

(1)細胞生長密度不高時，不能急于傳代。

(2)原代培養的貼壁細胞需控制消化時間。

(3)吹打已消化的細胞應減少機械損傷。

(4)首次傳代時細胞接種數量要多一些。

(5)首次傳代培養的pH應偏低些。小牛血清濃度可加大至15%～20%左右。

一、懸浮細胞的分離方法

1、將血液、羊水、胸水或腹水等懸液直接轉至離心管中，1000rpm/分鐘離心5分鐘。

2、去掉上清，離心沉淀用無鈣、鎂的PBS清洗后1000rpm/分鐘離心5分鐘。此步重復兩次。

3、用培養基重懸，調整適當細胞濃度后分瓶培養。

4、如選用懸液中某種細胞，可采用離心后的細胞分層液收獲目的細胞。

二、實體組織材料的分離方法

（一）機械分散法

1、纖維成分很少的腦組織，部分胚胎組織，用剪刀剪碎至1mm3的組織塊。

2、用PBS清洗兩次后

①用吸管吹打，分散組織細胞。

②或將已充分剪碎分散的組織放在注射器內（用九號針），使細胞通過針頭壓出。

③或在不銹鋼紗網內用鈍物（注射器鈍端）壓擠使細胞從網孔中壓擠出。

3、收集細胞轉入離心管中，1000rpm/分鐘離心5分鐘。

4、去上清，加入含血清的培養基，重懸后移至培養瓶中培養。

（二）消化分離法

1、酶消化分離法（過夜冷消化法）

①細胞間質較少的軟組織，如肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等，用Hanks液清洗組織三次，剪成碎塊大小為4毫米左右。

②再用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪組織。

③加入0.25%的胰蛋白酶，搖勻后放4℃過夜。

④次日再用Hanks液洗滌，棄去上清，共洗2-3次。

⑤加入少量含血清的培養基吹打分散，細胞計數，按適當的濃度分瓶培養。

2、非酶消化法（EDTA消化法）

①把組織塊剪碎，呈1mm3大小的組織塊。

②將碎組織塊在平皿中用無鈣鎂PBS洗2-3次。

③加入消化液（胰蛋白酶或膠原酶或EDTA）于37℃水浴中作用適當時間（中間可輕搖1~2次），若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續消化直至膨松絮狀為止。

④棄去上清，加入含有鈣、鎂離子的培養基中止消化反應，并洗滌2-3次后，加入完全培養基。

⑤用吸管吹打，使細胞充分散開后用紗網過濾后分瓶培養。

（三）原代細胞培養

原代培養是直接從生物體獲取細胞進行培養。由于細胞剛剛從活體組織分離出來，故更接近于生物體內的生活狀態。這一方法可為研究生物體細胞的生長、代謝、繁殖提供有力的手段，同時也為以后傳代培養創造條件。利用此方法還可直接服務于臨床實踐。例如，用從手術中切除的腫瘤細胞進行原代培養，然后用該培養細胞進行抗癌藥物的篩選，根據腫瘤細胞對加入的化療藥物的敏感性來幫助選擇最有效的化療方案，有可能起到增強療效、降低副作用的作用。

（四）原代細胞的傳代、保存

（1）傳代：依椐細胞的生長狀態，生長的細胞1：2或1：3進行傳代。

（2）保存：DMSO＋培養液＋血清

按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘）→冰箱冷凍室（30分鐘）→超低溫冰箱（－80℃過夜）→液氮。

（五）原代細胞的復蘇

（1）取出細胞，迅速放入37℃溫水中快速解凍。

（2）吸出細胞懸液，并加10倍以上培養液。

（3）用培養液適當稀釋后接種培養瓶，放入37℃CO2培養箱靜置培養。