導(dǎo)讀

自青霉素發(fā)現(xiàn)以來，抗生素已經(jīng)成為人類對抗細(xì)菌的最有效武器，挽救了無數(shù)人的生命，但隨著抗生素使用上的無節(jié)制，抗生素耐藥性已成為一個重大的全球問題。因此了解微生物對抗生素適應(yīng)的分子機(jī)制成為抗擊抗生素耐藥性（AMR）的一個重要途徑。

近日，法國巴斯德研究所的科學(xué)家運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測序、naica^®微滴芯片數(shù)字PCR等技術(shù)證實(shí)VchM（霍亂弧菌特有甲基轉(zhuǎn)移酶）參與應(yīng)對氨基糖苷類抗生素的應(yīng)激反應(yīng)，這表明，DNA甲基化在氨基糖苷類抗生素的耐藥機(jī)制中也發(fā)揮著重要作用，該文章刊載于《PLOS GENETICS》。

應(yīng)用亮點(diǎn)：

▶  運(yùn)用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)分析霍亂弧菌操縱子表達(dá)情況。

▶  VchM缺失會導(dǎo)致生長缺陷，但卻可以使霍亂弧菌對氨基糖苷產(chǎn)生應(yīng)激。

▶  VchM直接調(diào)節(jié)groES-2（伴侶蛋白編碼基因）的胞嘧啶甲基化，從而改變其表達(dá)情況，影響霍亂弧菌耐藥性。

氨基糖苷（AGs，如：妥布霉素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素和新霉素）是一類針對細(xì)菌核糖體小亞基的抗生素，其破壞翻譯保真度，增加細(xì)胞中錯誤折疊蛋白質(zhì)的水平。而本文的研究主要針對霍亂弧菌對其的耐藥性機(jī)理�？茖W(xué)家們在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，特定DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因突變（VchM）的霍亂弧菌相比WT具有更強(qiáng)的耐藥性，這表明DNA甲基化可能在霍亂弧菌適應(yīng)AGs中發(fā)揮作用。

VchM編碼一種Orphan m5C DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，導(dǎo)致5‘-RCCGGY-3’基序的胞嘧啶甲基化，雖然VchM的缺失會導(dǎo)致生長缺陷，但霍亂弧菌細(xì)胞可以在亞致死濃度和致死濃度的抗生素下對氨基糖苷應(yīng)激。

▲圖1：霍亂弧菌ΔVchM對亞致死濃度氨基糖苷的敏感性較低。GAs類，TOB（妥布霉素），0.6 μg/ml、GEN（慶大霉素），0.5 μg/ml、NEO（新霉素），2.0 μg/ml；非Gas類，CAM（氯霉素），0.4 μg/ml和CARB（β -內(nèi)酰胺類西林），2.5 μg/ml

對于ΔVchM霍亂弧菌的轉(zhuǎn)錄組測序和遺傳分析發(fā)現(xiàn)，ΔVchM菌株中有4個直接參與蛋白質(zhì)折疊的基因被上調(diào)。包括groEL-1，groEL-2，groES-1，groES-2。

通過naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對基因表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證分析發(fā)現(xiàn)，ΔVchM霍亂弧菌中g(shù)roES-2的表達(dá)在不同時期均有較大上調(diào)。進(jìn)一步通過缺失驗(yàn)證表明了groESL-2對ΔVchM的抗生素高耐受性的作用。

▲圖2：ΔVchM菌株中g(shù)roESL-2操縱子上調(diào)(對數(shù)生長期，Exp, OD600 ≈ 0.3；指數(shù)生長期，Stat, OD600 ≈ 1.8–2.0)

在groESL-2區(qū)域觀察存在四個VchM甲基化基序存在。進(jìn)一步對基序分析發(fā)現(xiàn)，破壞這些基序會導(dǎo)致groESL-2基因表達(dá)增加（如圖3）。且基序破環(huán)越多，則導(dǎo)致的表達(dá)上調(diào)更加明顯。同時，ΔVchM中的groESL-2基因表達(dá)一直高于基序突變，表明還存在其他因素與甲基化協(xié)同控制groESL-2表達(dá)。這些結(jié)果表明，在霍亂桿菌中，一組特定的伴侶蛋白編碼基因受DNA胞嘧啶甲基化的控制，將DNA甲基化與伴侶蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)和對抗生素的耐受聯(lián)系起來。

▲圖3：在WT中，groESL-2區(qū)域的VchM位點(diǎn)突變導(dǎo)致基因表達(dá)增加

法國巴斯德研究所是世界上最著名的研究所之一，成立130余年來一直走在世界科技前沿，是微生物學(xué)、免疫學(xué)、傳染病學(xué)等學(xué)科的起源地，曾開發(fā)出狂犬病疫苗、天花疫苗、流感疫苗、黃熱病疫苗等多個造福人類的疫苗產(chǎn)品，并培養(yǎng)了10名諾貝爾獎生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者，實(shí)現(xiàn)研究、教育、健康、創(chuàng)新“四位一體”的研究機(jī)構(gòu)。