CRISPR-Cas9技術徹底改變了基礎生物研究和應用生物技術的許多領域。但在臨床基因治療實施中脫靶效應的檢測仍然存在難題。德國漢堡大學-艾本多夫醫學中心（UKE）干細胞移植、細胞和基因治療研究所的學者們近日在知名雜志《Molecular Therapy》上發表“LATE–a novel sensitive cell-based assay for the study of CRISPR/Cas9-related long-term adverse treatment effects”的文章，建立了稱為LATE（長期不良治療效果鑒定檢測）的新型檢測方法，該方法使用Stilla naica^®微滴芯片數字PCR系統檢測低頻的脫靶事件，且有助于分析Cas9脫靶切割效應的影響，并可在單細胞層面進行評估。
 

為了證明LATE方法有助于檢測Cas9脫靶切割后的功能影響，研究人員進行了小規模的原理驗證實驗：明星基因TP53基因敲除后會導致細胞表現出相對生長優勢，這是主要的致瘤性標志之一，因此可以作為驗證“LATE”檢測脫靶能力的指示。本文選取TP53進行CRISPR靶向實驗，并轉染到有限稀釋后的原代人類新生兒包皮成纖維NUFF細胞中，通過“LATE”方法重復檢測到低頻(<0.5%)生長促進事件，這一結果證明了即使在低起始細胞數的情況下，LATE檢測也具有高靈敏度，并且可以對單個細胞進行評估。
 

圖 1. LATE檢測原理
 

LATE檢測的原理包括 (1)用編碼熒光蛋白、設計的核酸酶(Cas9)和gRNA的慢病毒載體轉導原代人類新生兒包皮成纖維細胞 (NUFF)，(2) 使用流式細胞術分析轉導率并連續監控長達10周，(3)讀取結果，隨著轉導細胞數量的增加，作為基因組編輯效應的細胞獲得生長優勢
 

在這一過程中，“LATE”讀取到的陽性結果（獲得生長優勢的細胞）會不會由TP53以外的基因被“脫靶敲除”引起，或者是序列存在其他的突變，例如插入誘變從而導致細胞獲得生長優勢呢?為了研究“LATE”檢測的陽性結果與TP53插入缺失之間的聯系，研究人員設計了GEF-dPCR（gene-editing frequency digital PCR）實驗，即Drop-Off分析方法，該方法可以量化gRNA結合位點以及脫靶位點的插入缺失頻率。
 

圖2. NUFF細胞獲得的生長優勢與TP53中的插入/缺失頻率相關 (A)TP53外顯子4片段和GEF-dPCR中使用的FAM、HEX標記探針的示意圖。(B) TP53插入/缺失頻率，數據由GFR-dPCR測量獲得。(C) 脫靶TP53插入/缺失頻率，由GEF-dPCR測量獲得。
 

對于TP53 gRNA結合位點的檢測，GEF-dPCR使用兩個雙標記水解探針，一個HEX標記探針與遠離gRNA識別序列的區域結合，易發生插入缺失的位點設計FAM標記的探針（圖2A）。

文中使用Stilla naica^®微滴芯片數字PCR系統進行GFR-dPCR方法檢測，實驗方法詳見原文第12頁。
 

隨后進行Stilla naica^®微滴芯片數字PCR系統檢測，結果顯示隨著時間的推移，TP53插入缺失的頻率隨之增加，轉導后第7天插入缺失率為1%–22%，在52天后達到44%–85%的峰值，該變化趨勢和細胞獲得生長優勢的趨勢一致。（圖2B）
 

研究人員還對TP53脫靶位點的插入缺失頻率進行了檢測（圖2C）。上述dPCR檢測結果也與NGS測序方法和RGB熒光標記方法一致，從而說明“LATE”能夠檢測TP53介導的gRNA的不良脫靶效應，但這些gRNA并沒有被常用的在線預測工具標記為“危險信號”。
 

隨后，作者還驗證了“LATE”可用于任何類型的設計核酸酶以及不同的CRISPR/Cas變體，并且可以擴展用于其他細胞類型，尤其是高度相關的原代hMSC。因此，“LATE”實驗方案可用于驗證特定細胞類型中特定設計核酸酶的脫靶效應的影響。
 

圖3：LATE檢測可應用于hMSCs和h-TERT永生化細胞
 

綜上，“LATE”可以作為一種簡單、快速和經濟的技術手段，用來評估CRISPR/Cas系統帶來的生理“副作用”影響，輔助臨床前的安全性研究，是對基于NGS的全基因組脫靶檢測方法的有效補充，特別是補充了流式和數字PCR的檢測結果。
 

原文:https://doi.org/10.1016/j.omtm.2021.07.004
 

期刊介紹：《Molecular Therapy》是美國基因治療學會(ASGT)的月刊，是基因轉導、載體開發與設計、干細胞制造、基因、肽、蛋白、寡核苷酸的開發、細胞療法、疫苗開發、臨床前目標驗證、安全性/有效性研究和臨床試驗等領域的領先期刊。《Molecular Therapy》致力于促進遺傳學、醫學和生物技術的科學發展，影響因子為6.698。