細胞把脈-細胞的狀態分析與解決操作方法
細胞養著養著就變樣了，狀態不好“生病了”，怎么辦？
教您細胞界的“望、聞、問、切”，給您的細胞“把把脈~”
細胞狀態不好，總結下來可以從以下幾點出發考慮：
導致細胞污染的原因主要有以下幾方面：
1. 環境：水浴鍋、培養箱水盤、細胞培養箱內壁、超凈臺、桌面及試劑瓶身、細胞房空氣消毒。
2. 操作：細胞復蘇、傳代、凍存等過程中也可帶入污染。
3. 試劑：血清、基礎培養基、胰酶、輔助試劑、營養添加物等。
4. 耗材：培養皿或培養瓶、槍頭。
5. 細胞本身：本身攜帶污染、細胞老化、分化等。
接下來我們按照此步驟一步步進行分析：
環境
環境需要考慮到的因素有：
水浴鍋、培養箱水盤
由于長期處于潮濕狀態，水是一個很重要的污染源，建議兩周更換一次高壓滅菌水。并且添加水浴鍋專用消毒預防試劑（Aquaguard-2，貨號: 01-916-1E）和培養箱水盤（Aquaguard-1，貨號: 01-867-1B）專用消毒預防試劑。
Aquaguard-1
用來消毒培養箱中的水盤，可有效殺滅細菌、芽孢、支原體、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒；無毒；對不銹鋼無腐蝕性；不揮發。
用法：
1. 培養箱建議每兩周進行一次系統地清潔和消毒。
2. 稀釋100倍即可使用，即將1L水中加入10ml的Aquaguard-1溶液。
用來消毒水浴鍋，可有效殺滅細菌、芽孢、支原體、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒。
用法：
1. 建議每周進行一次系統地清潔和消毒水浴鍋。
2. 稀釋500倍即可使用，即將1L水中加入2ml的Aquaguard-2溶液。
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細胞培養箱內壁
每星期需要清潔一次，保持潔凈狀態。每年對CO2、溫度探頭校準一次。 -
超凈臺、桌面及試劑瓶身
要經常擦拭，以防帶入外源污染。 -
細胞房空氣消毒
可選擇紫外殺菌、高錳酸鉀-甲醛熏蒸、過氧化氫-過氧乙酸干霧滅菌、臭氧滅菌等方法徹底清潔細胞房空氣，每種方式各有優缺點、可綜合考慮及比較后擇優使用。
培養箱內壁、超凈臺、桌面及試劑瓶身都可考慮使用：
Pharmacidal™ Sprays and Solution 消毒噴壺溶液
作用原理：Pharmacidal作用方式是使脂質變性，分解細胞膜的雙層磷脂質和增加細胞通透性，導致酶的滅活，蛋白質沉淀，與DNA和RNA產生反應。
特點：
1. Pharmacidal 對大部分的細菌、芽孢、支原體、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒都有效。
2. 不含汞、甲醛、苯酚和酒精，可生物降解、無毒、無刺激，對一般的工作臺面和器材沒有腐蝕性和任何損傷。
使用方法：
1. 可消毒橡膠手套、超凈臺面、桌面、顯微鏡臺、試劑瓶身等物體表面，噴涂完全濕潤，不需擦拭，自然風干。
2. 培養箱內壁噴涂完全濕潤后，等待10分鐘，用無菌吸水紙吸干內壁上的殘留液體。
操作
操作過程中人是最大的一個污染源，人類1個小時會脫落3*104-4*104個細胞；24小時會脫落108個細胞，1年會脫落3.6kg的死細胞。從人身上掉落的顆粒達到104/min（顆粒直徑0.5μm）。
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人 |
腳 |
100-1000 個微生物/cm2 |
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頭皮 |
106個微生物/cm2 |
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額頭 |
105個微生物/cm2 |
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噴嚏 |
104 – 105個微生物 |
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唾液 |
107個微生物/mL |
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無菌服 |
6小時后 |
1 – 6個微生物/cm2 |
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空氣 |
戶外 |
100 – 500個微生物/m3 |
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戶內 |
500 – 2000個微生物/m3 |
人類的皮膚總面積約2m2，生活約1012個微生物；我們1g的排遺物中約有1012個微生物。
如何進行污染源排查？
可通過控制變量法對整個培養操作流程進行分析：培養試劑及輔助試劑等條件不變，重新復蘇一株細胞，復蘇時水浴要注意水浴不能沒過凍存管瓶蓋，傳代時不能觸碰吸管尖頭部或容器瓶口。操作前需要用75%的酒精擦拭無菌操作臺面。觀察細胞是否有污染現象。
試劑
☆ 空培不能用于污染來源排查
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分別空培胰酶、PBS、凍存液、高壓水。即便存在污染，但是由于營養（碳源、氮源、無機鹽、生長因子）不完全，不一定會像實驗中那樣長出菌斑。
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空培血清時，因為血清中富含蛋白，空培過程中會有沉淀產生，并且隨著培養時間的延長，沉淀會逐漸增多，而這些沉淀往往會被誤以為是污染。
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空培完全培養液（血清+基礎培養基）時，首先要會區分沉淀和污染。因此對經驗要求高。其次，若完全培養基培養后有污染出現，也不好判斷是血清還是基礎培養基，或者是操作過程中帶入的污染。
如何進行污染源排查？
血清：其他試劑保持不變，僅更換血清。
基礎培養基：其他試劑保持不變，僅更換基礎培養基。
PBS：其他試劑保持不變，僅更換PBS。
胰酶：若細胞復蘇的很好，一傳代就污染，可以嘗試其他試劑保持不變，更換消化用胰酶，看細胞狀態。
細胞反復復蘇都會出現污染，那可保持培養體系不變，培養其他類型且適用于此培養體系的細胞，觀察是否有污染出現。整個營養體系：基礎培養基、血清、營養添加物都可使用控制變量法進行排查。
耗材
培養基及輔助試劑等條件不變，使用新耗材（培養皿或培養瓶、槍頭）培養細胞，觀察細胞是否有污染。
細胞本身
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細胞本身攜帶污染源。可對細胞進行無菌檢測（細菌、真菌、支原體）。
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細胞分化，細胞一旦分化，很難逆轉，無法通過外界營養體系和生長條件的調整“起死回生”。
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細胞老化：細胞一旦老化，是無法逆轉的。
因此，大家需要學會觀察細胞的形態并進行分析，可以按照這幾點進行控制變量排查，如若確認是細胞本身問題，若細胞本身不是很昂貴，建議丟掉重新培養，若較珍貴，污染后可嘗試根據污染種類選擇合適的抗生素進行殺滅，分化和老化是沒有辦法補救的。
好啦，今天的講解就到這里啦，
細胞出現問題的老師也不要著急哦，
按照上述辦法可以自行排查下污染源，
根據結果選擇相應對策解決問題~
祝各位老師實驗順利哦
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