第二近紅外窗口(NIR-II，1000–1700nm)中的熒光成像顯示出較少的光散射以及在活組織中可忽略的背景自熒光，從而導致更深的穿透深度和更高的時空分辨率。因此，非常需要開發近紅外II區的靈敏的NTR熒光開-關探針，以精確描繪腫瘤邊緣。作者報道了一種新型的用于腫瘤成像的硝基還原酶激活的近紅外熒光探針RHC-NO2。該探針可以發射900–1300納米范圍內的熒光，并靶向NTR過表達的低氧腫瘤，雖然探針本身顯示的熒光可以忽略不計；然而，在與NTR反應時，產生了大大增強的近紅外熒光信號，檢測限低至5.9ng/mL，比現有的NTR近紅外二區（NIR-II）的熒光開-關探針低一個數量級左右(約50 ng/mL) 。RHC-NO2探針的高靈敏度使得通過檢測低氧腫瘤中的NTR來精確地對腫瘤邊緣成像成為可能，并且這種潛力已經被荷瘤小鼠模型的體內成像所證明。因此，作者認為該探針可能為腫瘤邊緣的診斷研究提供一種方便的方法。

首先，作者使用氫化羅丹明聚甲川框架設計了發射峰在921 nm的RHC-NO2探針，該探針使用一個硝基作為NTR特異性識別部分以及熒光猝滅劑。當探針與NTR（硝基還原酶）反應時，硝基被還原成氨基，921 nm處的熒光被相應地恢復(方案1)。

方案1:  用于NTR（硝基還原酶）檢測的RHC-NO2的傳感機制。
 

在 p H 7.4的PBS中測得有和沒有NTR（硝基還原酶）的探針的吸收光譜 。如圖1A所示，探針RHC-NO2在677 nm處顯示出最大吸收，添加NTR導致在868 nm處出現新的吸收峰，這可能歸因于反應產物RHC-NH2的形成。圖1B描述了有和沒有NTR的RHC-NO2的發射光譜，盡管探針本身由于硝基的猝滅作用沒有熒光 (量子產率Ф< 0.01%)，但與NTR的反應使其在921 nm產生強熒光(約14倍增強)。這些結果表明探針與NTR反應時可能產生RHC-NH2。

圖1：RHC-NO2(10μM)與NTR(10μg/mL)在含有10%胎牛血清(FBS)的pH 7.4磷酸鹽緩沖液中存在NADH (200 μM)的情況下反應前(a)和反應后(b)的吸收(A)和發射(B)光譜。

在優化的條件下(200 μM NADH，含10% FBS的pH 7.4的PBS中，37℃下反應1 h)，RHC-NO2在不同濃度NTR下的熒光響應如圖2A和B所示，表明921 nm處的熒光強度隨著NTR的增加而逐漸增加。在1-10 μg/mL范圍內，△F和NTR的濃度有很好的線性關系，方程表示為：△F=1657×[C(μg/mL)]-730(R=0.004)，檢測限低至5.9ng/mL，其中△F是在921 nm處有和沒有NTR的RHC-NO2的熒光強度之差。這些觀察結果表明，通過在近紅外窗口中檢測痕量濃度的NTR，RHC-NO2可用于體內成像。為了深入了解探針的選擇性，在存在各種潛在干擾物質的情況下測試了熒光響應。如圖2C所示，在測試的物質中沒有檢測到顯著的熒光響應，被測試物質包括無機鹽(Na2S、氯化鈣、硫酸銅、硫酸亞鐵、KCl、氯化鎂、氯化鋅)、維生素C、葡萄糖、活性氧(H2O2，N a O C l，N a N O2，·OH, ONOO-)和生物硫醇(半胱氨酸、谷胱甘肽)。相比之下，NTR的加入導致顯著的熒光增加，表明即使在復雜的生物環境中，RHC-NO2也表現出對NTR的高選擇性。

圖2：(A)RHC-NO2(10 μM)對不同濃度NTR(0–10 μg/mL)的熒光響應。(B) △F對NTR濃度的線性擬合曲線

(C)RHC-NO2對各種物質(從1到18)的熒光響應:空白、半胱氨酸(1 mM)、谷胱甘肽(1 mM)、Na2S (100 μM)、維生素C (1 mM)、H2O2(100 μM)、NaOH(100 μ M)、NaNO2 (100 μ M)、·OH (100μM)、Ca2+(2 mM)、Cu2+(100 μM)、Fe2+(100 μ M)、葡萄糖(10 mM)、K+(150 mM)、Mg2+(2 mM)、Zn2+(100 μ M)、ONOO-(200 μ M)，NTR (10 μg·mL-1).
 

最后，作者將RHC-NO2探針應用于活體動物腫瘤的近紅外熒光成像。在該實驗中，選擇攜帶皮下A549腫瘤的雌性BALB/c裸鼠作為模型，探針RHC-NO2靜脈注射入A549荷瘤小鼠。從圖3可以看出，在注射約12小時后，腫瘤中的熒光強度逐漸增加，并且檢測到最大的NIR-II信號。然后，熒光隨時間減少。最重要的是，注射4小時后腫瘤與周圍的正常組織變得可區分，并且腫瘤邊界保持清晰直到約24小時。值得注意的是，在注射探針后，除腫瘤區域外，在小鼠身體的其他部位也觀察到熒光，這可能歸因于探針通過肝臟和腎臟的代謝(這種代謝途徑在先前報道的文獻中非常常見)。此外，注射24小時后，腫瘤中的熒光保持明亮，而其他器官中的熒光變得相當弱。因此，可以選擇24 h作為A549腫瘤熒光成像和鑒定的時間點。這些結果證明了RHC-NO2在生物成像中描繪腫瘤邊緣的能力。

圖3：A549荷瘤小鼠(n = 3)尾靜脈注射RHC-NO2(200 μL，500 μ M)后的代表性NIR-II圖像
 

解剖小鼠以分析探針在主要器官和腫瘤中的離體生物分布。發現在靜脈注射RHC-NO2至A549荷瘤小鼠48小時后，在解剖的腫瘤、肝臟和腎臟中觀察到NIR-II熒光(圖4)。這可能是因為肝膽系統和腎臟系統中的這兩個器官負責將探針從體內清除。上述結果表明，RHC-NO2可作為一種潛在的近紅外熒光探針用于癌癥治療。

圖4：在尾靜脈注射RHC-NO2(200 μL ，500 μ M)后，RHC-NO2在A549荷瘤小鼠體內的離體生物分布。 

(A)注射RHC-NO2 48小時后，解剖器官和腫瘤的近紅外-II區熒光成像

(B)A549荷瘤小鼠(n = 3)的定量熒光強度。

參考文獻

Zhang Xiaofan, et al."Sensitive imaging of tumors using a nitroreductase-activated fluorescence probe in the NIR-II window.." Chemical communications (Cambridge, England) .(2021): doi:10.1039/D1CC03232A.
 

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