什么鬼？實驗結(jié)果又不理想， Ct 值怎么又這么大呢？是哪一步出現(xiàn)了問題呢？

哎哎哎，怎么沒有擴增曲線呢？

在您看到熒光定量  PCR  實驗結(jié)果時，是不是也發(fā)出過這樣的疑問呢？總感覺哪個實驗步驟出現(xiàn)了問題，但又覺得每一步都沒問題，真不知該從何下手啊。哎，腦瓜疼，怎么辦，怎么辦，該怎么辦呢？不怕，不怕，「對照」來了，幫您排憂解難。

熒光定量  PCR  實驗中，從樣本的采集到結(jié)果分析包括多個實驗步驟，不同的實驗步驟可以選擇不同的對照進行監(jiān)控（表格 1）。

對照種類		樣本采集	樣本保存	核酸提取	逆轉(zhuǎn)錄	擴增
陰性對照	無模板陰性對照					√
	無逆轉(zhuǎn)錄酶對照				√	√
	陰性樣本對照			√	√	√
陽性對照	擴增對照					√
	內(nèi)部陽性對照			√	√	√
	陽性樣本對照			√	√	√
	內(nèi)參基因	√	√	√	√	√

  在熒光定量 PCR 實驗中，有時候無法判斷某個反應孔中的擴增是來自于樣本的真實擴增呢？還是來源于污染呢？這時，就需要陰性對照來監(jiān)控和發(fā)現(xiàn)污染的發(fā)生。常見的陰性對照包括以下幾種：

1、無模板對照：
無模板的陰性對照（No Template Control，簡稱 NTC）是指使用了水代替熒光定量 PCR 反應中的核酸，其他的試劑按比例正常加入，用于監(jiān)測反應體系中的污染。正常情況下，NTC 孔中不會有擴增；當 NTC 孔出現(xiàn)擴增時，則預示體系中可能有污染。在 SYBR Green 實驗中，EZBioscience 分子生物學實驗室總結(jié)出了容易導致 NTC 出現(xiàn)擴增的兩種情況：一是通過觀察熔解曲線，如果 NTC 與目的基因熔解曲線峰形不重疊（一般 NTC 的 Tm 值較目的基因 Tm 值小），這種情況下，NTC 的 Ct 值是由引物二聚體造成的，此時可通過優(yōu)化引物的設計來減少引物二聚體對結(jié)果的影響。二是 NTC 與目的基因的熔解曲線峰形重疊（即 NTC 的 Tm 值等于目的基因的 Tm 值），此時需要計算目的基因的 Ct 值與 NTC 的 Ct 值的差值（△Ct）：如果 △Ct ≥ 3，氣溶膠的污染程度很低，目的基因的 Ct 值可正常使用；如果 △Ct＜3，說明污染已經(jīng)很嚴重了，目的基因的 Ct 值是不能使用的。此時就需要想方設法消除體系中的氣溶膠污染。

2、無逆轉(zhuǎn)錄酶對照
無逆轉(zhuǎn)錄酶對照（No Reverse-Transcriptase Control，No RT）：在進行逆轉(zhuǎn)錄實驗時，不加逆轉(zhuǎn)錄酶，進行逆轉(zhuǎn)錄步驟得到的 cDNA 進行后續(xù)的熒光定量 PCR 檢測。如果檢測到擴增，則樣本中可能含有未去除干凈的基因組 DNA。
EZBioscience®的 EZscript All-in-one Reverse Transcription Kit (with DNase)（貨號：RT3），是一款基因組 DNA 去除與逆轉(zhuǎn)錄反應在一步進行的新一代快速逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，包含有設置無逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄陰性對照反應所需的 NC Buffer，便于檢測 RNA 模板中是否有基因組 DNA 的殘留。

3、陰性樣本對照
陰性樣本對照（Negative Sample Control）是指不表達目的基因的樣本，也可以是樣本保存液。對陰性樣本進行了提取、逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量 PCR 檢測。如果出現(xiàn)擴增，則說明其中的某一個實驗過程出現(xiàn)了污染，結(jié)合 NTC 的結(jié)果，來判斷是否樣本提取過程中引入了污染。 熒光定量 PCR 實驗中，當樣本孔出現(xiàn)一個無擴增或者 Ct 值偏大的，我們不知道到底是真的沒有檢測的目的基因表達呢，還是實驗的某個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題了呢。為了發(fā)現(xiàn)這種假陰性的發(fā)生，合理的陽性對照可以監(jiān)控實驗的不同步驟： 擴增對照（Amplification Control）：可使用含有目的基因片段的質(zhì)粒、假病毒或者基因組 DNA/cDNA 作為擴增陽性對照，監(jiān)控熒光定量 PCR 的反應體系是否正常。當擴增對照 Ct 值大于預期或者沒有擴增，則說明定量 PCR 體系存在問題。 陽性樣本對照（Positive Sample Control）：通過選擇陽性的樣本作為單獨的樣本進行提取和后續(xù)的 RT-PCR，通過 Ct 值評判實驗流程。
  內(nèi)部陽性對照（Internal Positive Control，IPC）是指在 RNA 提取，向每個待檢測樣本中加入特定拷貝數(shù)的外源 DNA 或 RNA（不含目的片段），并在熒光定量 PCR 中進行單管多重 PCR，同時檢測目的基因和這段序列，進而通過 Ct 值判斷對應樣品中的核酸富集和擴增效率。 內(nèi)參基因（Endogenous Control）：實驗過程中可通過內(nèi)參基因的 Ct 值來判斷取樣本降解情況。

希望通過以上的介紹，大家以后做熒光定量 PCR 實驗時能夠得心應手，得到好的實驗結(jié)果，Paper 發(fā)發(fā)發(fā)！