文章標(biāo)題：Near-infrared oxidative phosphorylation inhibitor integrates acute myeloid leukemia–targeted imaging and therapy

發(fā)表期刊：SCIENCE ADVANCES

發(fā)表時(shí)間：2021 January

影響因子：13.116

合作客戶(hù)：陸軍軍醫(yī)大學(xué)

百趣生物提供服務(wù)：中心碳代謝高通量靶標(biāo)定量

 

1.研究背景

 

急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia, AML）是一種致死性惡性腫瘤，由造血系統(tǒng)的髓系原始細(xì)胞惡性增殖并干擾正常血細(xì)胞生成導(dǎo)致，患者臨床表現(xiàn)為貧血、出血、感染、發(fā)熱、臟器浸潤(rùn)和代謝異常等。AML的病情發(fā)展迅速，如不及時(shí)治療，患者可能在數(shù)月甚至數(shù)周內(nèi)死亡；而更為棘手的是AML有幾率在治療后再次發(fā)作。目前治療AML的最大挑戰(zhàn)在于缺乏靶向定位顯示和殺傷異質(zhì)性白血病細(xì)胞的手段，治療后殘留的白血病細(xì)胞再次增殖從而導(dǎo)致AML復(fù)發(fā)。

 

近年來(lái)腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展過(guò)程的相關(guān)研究給予了治療AML非常重要的提示。糖酵解代謝通路的特異性增強(qiáng)，甚至在有氧環(huán)境中仍然傾向無(wú)氧糖酵解代謝是腫瘤細(xì)胞的重要標(biāo)志之一。白血病細(xì)胞也屬于腫瘤細(xì)胞，同樣遵循相同的規(guī)律，因此過(guò)于活躍的糖酵解代謝是定位和治療AML的常規(guī)突破點(diǎn)。

 

早期的研究策略集中于抑制糖酵解，但是糖酵解抑制劑在治療AML上并沒(méi)有獲得令人滿意的效果。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，一些類(lèi)型的腫瘤比如腦癌和AML，除了糖酵解外，還能依靠于線粒體特有的氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）來(lái)維持生物能量和生物合成的進(jìn)程。特別是抵抗化療后的殘存白血病細(xì)胞，普遍地表現(xiàn)出線粒體體積增大，保持線粒體極化狀態(tài)等現(xiàn)象，更加依賴(lài)線粒體氧化磷酸化并籍此生存。因此突破治療AML的重點(diǎn)更傾向于針對(duì)白血病細(xì)胞線粒體的氧化磷酸化。

 

數(shù)種治療策略，比如抑制線粒體蛋白合成或抑制線粒體電子傳遞鏈，在治療AML中都表現(xiàn)出很好的潛力。然而線粒體是細(xì)胞代謝的重心，由于涉及生物能量和生物合成的進(jìn)程，包括白血病細(xì)胞，幾乎所有類(lèi)型的細(xì)胞（正常細(xì)胞）也都依賴(lài)于線粒體的完整性和各項(xiàng)功能。現(xiàn)有的氧化磷酸化抑制劑在抗腫瘤治療的應(yīng)用中不僅限制對(duì)腫瘤細(xì)胞線粒體機(jī)能的理解，而且存在缺乏對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向定位，在腫瘤細(xì)胞中無(wú)法積累到有效治療濃度等問(wèn)題。抑制劑不能靶向定位還會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，比如神經(jīng)毒性、惡心嘔吐等癥狀。

 

2.化合物IR-26的設(shè)計(jì)思路

 

針對(duì)上述問(wèn)題，現(xiàn)階段的策略在于同時(shí)提升藥劑對(duì)腫瘤細(xì)胞靶向定位的能力和對(duì)腫瘤細(xì)胞線粒體氧化磷酸化抑制的能力。陸軍軍醫(yī)大學(xué)史春夢(mèng)課題組之前已經(jīng)在這一領(lǐng)域取得了可喜的研究成果，合成了能夠靶向定位實(shí)體腫瘤線粒體的七甲川花菁類(lèi)近紅外熒光小分子化合物（heptamethine cyanine dyes，HCD）。承接這一思路，為了能夠更好的針對(duì)白血病細(xì)胞，本文作者在HCD的基礎(chǔ)上增加了水溶性氨基酸基團(tuán)，設(shè)計(jì)出集靶向定位、成像檢測(cè)和治療于一身新化合物IR-26（圖一）。

 

和之前HCD在實(shí)體腫瘤線粒體的特異選擇性積累一致，新設(shè)計(jì)的IR-26在白血病細(xì)胞中也保持了這一特性。水溶性的IR-26的重大改進(jìn)在于避免分子間氫鍵的形成，減少J聚集體的形成和血蛋白的結(jié)合率，更有利于靶向定位白血病細(xì)胞。IR-26保留了近紅外熒光的功能，吸收和發(fā)生峰在700-900nm之間。這個(gè)波段的近紅外線對(duì)組織具有高穿透性和低背景的自體熒光干擾，十分有利于成像。基于上述優(yōu)點(diǎn)，IR-26能在活體檢測(cè)中應(yīng)用流式細(xì)胞儀動(dòng)態(tài)檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞，這對(duì)于持續(xù)監(jiān)測(cè)疾病發(fā)生，治療響應(yīng)和疾病復(fù)發(fā)有重要的意義。

圖一 七甲川花菁類(lèi)近紅外熒光小分子化合物IR-26合成路線及結(jié)構(gòu)
 

3.化合物IR-26對(duì)AML的靶向定位和成像

 

為了研究IR-26的靶向定位和成像能力，外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）和白血病細(xì)胞HL-60被分別和IR-26孵育，發(fā)現(xiàn)IR-26優(yōu)先被白血病細(xì)胞吸收（圖二A）。白血病細(xì)胞的其它種類(lèi)細(xì)胞系如NB4和THP-1相比PBMCs也會(huì)優(yōu)先吸收IR-26（圖二B）。而在活體實(shí)驗(yàn)中，無(wú)胸腺裸鼠（GFP標(biāo)記HL-60腫瘤細(xì)胞實(shí)體腫瘤），對(duì)其靜脈注射0.2 mg/kg的IR-26, 成像結(jié)果表明，IR-26的成像非常清晰，與GFP成像結(jié)果一致而熒光背景更低（圖二 C）。

圖二 IR-26在體外和活體中的靶向定位和成像
 

 

A PBMC和HL-60吸收IR-26后熒光強(qiáng)度（吸收越多，熒光越強(qiáng)）；B PBMC和多種白血病細(xì)胞吸收IR-26后共聚焦成像照片；C 無(wú)胸腺裸鼠誘導(dǎo)GFP標(biāo)記HL-60細(xì)胞腫瘤，注射IR-26后的彩照，NIR熒光成像，GFP熒光成像和X光成像。

 

為進(jìn)一步調(diào)查IR-26在外周血中對(duì)白血病細(xì)胞的靶向定位能力，外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）和預(yù)先構(gòu)建好的GFP標(biāo)記HL-60細(xì)胞被混合到一起來(lái)模擬復(fù)雜的外周血組分，同時(shí)加入5μM IR-26在37℃ 孵育。結(jié)果顯示IR-26能夠清晰顯示標(biāo)記的HL-60細(xì)胞（圖三A）。而在白血病患者和健康志愿者的外周血比對(duì)中，IR-26也能夠清晰地識(shí)別患者血液中的白血病細(xì)胞（圖三B）。此外，還將GFP標(biāo)記HL-60細(xì)胞注入輻照處理后的C57BL/6 小鼠體內(nèi)建立AML模型，培養(yǎng)20天后將模型進(jìn)行冰凍切片觀察，發(fā)現(xiàn)HL-60細(xì)胞除在外周血分布外，還會(huì)侵入脾臟和骨髓，而IR-26對(duì)所有位置的白血病細(xì)胞均能清晰成像（圖三 C）。

圖三 IR-26在混合細(xì)胞、AML患者/健康志愿者和小鼠模型中對(duì)白血病細(xì)胞的定位和成像
 

 

A PBMC和HL-60混合吸收IR-26后熒光強(qiáng)度（由于只靶向白血病細(xì)胞，并被優(yōu)先吸收，成像只顯示HL-60）；B 白血病患者和健康志愿者外周血和IR-26孵育后成像；C 小鼠AML模型（注入GFP標(biāo)記HL-60細(xì)胞）的不同部位成像。注：DAPI為4',6-二脒基-2-苯基吲哚，可以透過(guò)完整細(xì)胞膜，用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。

 

4.化合物IR-26對(duì)AML的治療效果

 

在選擇性殺死白血病細(xì)胞方面，IR-26也有優(yōu)異的表現(xiàn)，對(duì)于AML的兩類(lèi)細(xì)胞HL-60和THP-1的半抑制率（IC50）在2.629 和2.351μM（圖四 A）。免疫印跡（圖四 B）和雙熒光標(biāo)記（圖四 C）結(jié)果均顯示IR-26能夠有效地引導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。

圖四 IR-26對(duì)AML細(xì)胞的抑制率、免疫印跡和雙熒光標(biāo)記
 

正常造血干細(xì)胞（HSCs）和白血病細(xì)胞（HL-60）加入不同濃度IR-26后，對(duì)比細(xì)胞存活率，IR-26能夠?qū)Π籽�病�?xì)胞進(jìn)行專(zhuān)一殺傷，即使是在對(duì)HL-60有高殺傷率的較高濃度時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞損害也很小（圖五）。
 

圖五 造血干細(xì)胞（HSCs）和白血病細(xì)胞（HL-60）在不同濃度IR-26下細(xì)胞存活率
 

在小鼠活體模型方面，構(gòu)建了兩個(gè)模型來(lái)測(cè)試IR-26的有效性。第一個(gè)模型通過(guò)在裸鼠皮下注射HL-60細(xì)胞產(chǎn)生實(shí)體腫瘤，當(dāng)腫瘤達(dá)到一定大小后，將裸鼠隨機(jī)分為3組，分別腹腔注射PBS、阿糖胞苷和IR-26。結(jié)果顯示IR-26對(duì)于實(shí)體腫瘤的抑制作用顯著強(qiáng)于PBS組和阿糖胞苷組（圖六）。

圖六 小鼠腫瘤模型中 IR-26與PBS、阿糖胞苷對(duì)腫瘤大小（A）和質(zhì)量（B）的抑制作用
 

第二個(gè)模型采用了非肥胖糖尿病/免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠，通過(guò)尾部靜脈注射標(biāo)記了GFP的人源AML細(xì)胞 HL-60來(lái)構(gòu)建常規(guī)白血病模型（非實(shí)體腫瘤）。移植AML細(xì)胞后一周，小鼠分別注射5次阿糖胞苷或IR-26，25天后解剖小鼠并觀察器官。結(jié)果顯示對(duì)照組和阿糖胞苷組的小鼠各個(gè)器官都被白血病細(xì)胞侵入，呈現(xiàn)強(qiáng)GFP熒光，而IR-26治療的小鼠，其器官幾乎沒(méi)有GFP標(biāo)記HL-60細(xì)胞的綠色熒光（圖七A）。此外，IR-26治療的小鼠，其生存時(shí)間也顯著長(zhǎng)于對(duì)照組或者阿糖胞苷組（圖七B）。

圖七 AML模型的不同治療對(duì)于白血病細(xì)胞侵入器官的效果和小鼠治療后的生存時(shí)間
 

5.IR-26治療AML的分子機(jī)制

 

對(duì)于IR-26阻斷線粒體功能的機(jī)制，本文也進(jìn)行了探索。通過(guò)比對(duì)線粒體特異染料Mito Tracker 和IR-26的紅外熒光成像，證實(shí)IR-26的亞細(xì)胞定位為細(xì)胞線粒體（圖八A）。在線粒體吸收IR-26后，會(huì)導(dǎo)致線粒體腫脹并形成空泡（圖八B）。隨后的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IR-26所在的線粒體會(huì)顯著產(chǎn)生高含量活性氧（ROS）（圖八C），而加入線粒體靶向超氧化物歧化酶（MitoTEMPO）后，可以在一定范圍內(nèi)逆轉(zhuǎn)IR-26導(dǎo)致的ROS產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡（圖八D）。

圖八 IR-26的亞細(xì)胞定位、線粒體形態(tài)、ROS含量和清除ROS后的細(xì)胞生存率

對(duì)于ROS的產(chǎn)生，更深入的機(jī)制則涉及線粒體的TCA循環(huán)和呼吸電子傳遞鏈。文中也對(duì)這兩個(gè)部分進(jìn)行了探索。對(duì)于TCA循環(huán)，發(fā)現(xiàn)在IR-26在5-10μM的濃度下，電子傳遞鏈的復(fù)合物II的底物琥珀酸濃度會(huì)顯著上升，而下游代謝物延胡索酸和蘋(píng)果酸的濃度則顯著下降（圖九 A）。而使用氧化磷酸化試劑盒證實(shí)了TAC循環(huán)的代謝變化確實(shí)是由于電子傳遞鏈的復(fù)合物II和V受到抑制導(dǎo)致的（圖九 B）。從線粒體組分來(lái)看，下拉實(shí)驗(yàn)表明IR-26會(huì)特異性結(jié)合線粒體蛋白ATP5B, SDHA和NDUFS1，最終導(dǎo)致呼吸電子傳遞鏈?zhǔn)Щ睢?/SPAN>

圖九 IR-26的對(duì)于TCA循環(huán)、呼吸電子傳遞鏈和線粒體蛋白的作用
 

6.總結(jié)

 

文章實(shí)驗(yàn)針對(duì)急性髓系白血病的特點(diǎn)設(shè)計(jì)了靶向成像和治療一體化的化合物IR-26，該化合物能夠靶向定位AML細(xì)胞，熒光成像清晰準(zhǔn)確。在治療方面，IR-26可以有效殺傷AML細(xì)胞，對(duì)正常細(xì)胞和治療個(gè)體的副作用很小。治療機(jī)制方面，IR-26通過(guò)錨定ETC蛋白、SHDA和ATP5β；抑制電子傳遞鏈的復(fù)合體II和復(fù)合體V進(jìn)而抑制線粒體氧化磷酸化并產(chǎn)生ROS使得AML細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。

 

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