血球計數板一直是實驗室細胞計數的金標準。早在18世紀的法國，醫生就開始用血球計數板分析病人的血液樣本。經過100多年的不斷改進，如今的血球計數板相比其原型在準確性和便捷程度上都有了大幅提高，成為了現代細胞學研究的重要工具之一（對該歷史感興趣的小伙伴，請參考《血球計數板的前世今生》）。然而，因血球計數板固有的設計和使用方法帶來的計數誤差依然存在。相信不少小伙伴都有為忽高忽低的計數結果抓狂和被巨大的CV值所震驚的經歷…… 今天我們就來談談血球計數板的誤差來源以及如何避免或降低這些誤差。

血球計數板的計數誤差主要來自于三個方面：

      ● 隨機誤差

      ● 人為誤差

      ● 系統誤差

隨機誤差

隨機誤差又叫偶然誤差，是即使在完全消除系統誤差這種理想情況下，多次重復測量同一對象，仍會由于各種偶然的、無法預測的不確定因素干擾而產生的測量誤差。簡言之，這類誤差是一種自然規律，是無法避免的。

1881年，統計學家Lyon和Thoma推算出血球計數板的隨機誤差公式為：

其中n為所計算的細胞數

1907年，以發明了Student’s t-test而聞名的Willian Seal在一篇文獻中推導出了同樣的公式 [1, 2]。下表是用標準Neubauer型血球計數板測量不同濃度的細胞樣本時4個大方格的細胞數和理論隨機誤差：
 

可見細胞濃度越高，檢測細胞數越多（即樣本量越大），隨機誤差越低。因此，為了降低隨機誤差，我們可以：

-  提高細胞濃度（濃縮樣本）

-  增加檢測細胞數量（多數幾個大方格）

-  增加重復檢測的次數
 

增加細胞濃度和計數總數可以降低隨機誤差，但是濃縮步驟會引入新的誤差，操作者也需要花更多的時間用于計數。流式細胞儀或基于成像原理的自動細胞計數儀可在短時間內分析大量細胞（比如Cellaca MX一次計數的視野要遠遠大于血球計數板，分析最快只需2秒），提高效率的同時降低了隨機誤差。另外，儀器可以測量的濃度范圍比血球計數板更廣（比如Cellometer細胞計數儀的檢測范圍為1x10^5 – 1x10^7細胞/ml），可以省去濃縮或稀釋步驟。

人為誤差

有的小伙伴可能會說，我的樣本濃度應該有1x10^6細胞/ml，但為什么我計數的CV值有時候會超過30%呢？這個鍋，統計學家們可不背！細胞計數誤差的另一個重要來源就是人為誤差。早在1964年統計學家Fruend和Carol就發表文獻指出不同操作者檢測同一樣本的計數差異可高達52% ；同一操作者不同次計數間的差異也可達到20% [3]。是不是觸目驚心？

人為誤差有哪些呢？該怎樣減少或避免呢？我們一條一條來看。

混勻

• 混勻所用的體積至少為溶液總體積的20%。比如混勻1 ml的溶液，需要將移液器體積調到至少 200 µl。試想如果用10 µl的移液器去混勻1 ml的細胞懸液，會有怎樣的后果？
• 槍頭尖端應放置在溶液的中部，不要離液面或底部太近
• 移液器上下吹打10次，力度適中，避免產生氣泡。成團嚴重的細胞可增加吹打次數
• 從較大容器（比如T25、T75燒瓶）中取樣時，應先用5 ml或10 ml移液器混勻，取出樣本加入較小容器（比如離心管）后再用小量程的移液器和槍頭繼續吹打混勻

稀釋和取樣

• 確保稀釋倍數計算正確
• 原液混勻后應立刻取樣，避免細胞沉淀。如果等待時間過長，應重新混勻再取樣
• 如果稀釋倍數很高（比如1:100甚至1:1000），建議梯度稀釋（比如連續做2到3次1:10的稀釋），避免原液體積過小造成誤差
• 同一樣本的重復取樣應在短時間內完成。如果時間過長，應重新混勻再取樣

計數
細胞判斷標準必須統一

• 活細胞和死細胞如何定義？
• 壓線細胞如何數（數上不數下？數左不數右？）
• 成團細胞數一個還是分開數？

混勻、稀釋和取樣都是生物實驗的基本操作。除了細胞計數，這些基本功在其他的實驗中也是必不可少的。所以小伙伴們要好好修煉啊！當然，如果你的實驗室是土豪級別，可以用自動化設備（比如液體工作站）完成這些操作，那也是極好的。

細胞的判斷標準是計數誤差來源中主觀性最強的一個因素。即使有統一的標準，在執行時也難免有所偏差，所以才會出現前文提到的觸目驚心的操作者之間和不同次計數間的差異。自動細胞計數儀由軟件的參數定義和識別細胞，判斷標準不會隨人、時間或其他條件而改變，可以完美解決這一問題。

系統誤差
系統誤差是非隨機誤差，是由測量與分析過程中某些固定的原因引起的一類誤差，它具有重復性、單向性和可測性。就如同打靶時如果每次都擊中同一區域，但都離靶心相去甚遠，那么擊中的區域到靶心的距離就是系統誤差。
 

在細胞計數中，我們可以把隨機誤差和人為誤差控制到最低，得到很好的可重復性（即很小的CV值，很高的精密度），但是測得的結果有可能和實際值仍有差異（即較差的準確度）。此時就需要考慮到系統誤差，主要包括血球計數板的品牌、工藝和規格以及其他器材的選擇。

血球計數計數板

• 必須從正規渠道購買正規品牌的血球計數板
• 血球計數板的蓋玻片必須使用原裝配套的。蓋玻片的材質、重量和尺寸的變化會直接影響計數室的高度和體積
• 蓋玻片須擺放正確以確保加樣體積準確
• 使用過的血球計數板必須清洗干凈、晾干后再使用，避免樣本間交叉污染

血球計數板屬于精密設備，在使用時有諸多細節需要注意，步驟繁瑣。而且每次只能加載兩個樣本，耗費精力，效率低下。一次性標準規格的計數板（比如Cellometer計數板）的體積和計數面積固定，在出廠時都經過精密測量，不存在使用不當造成的差異，也避免了樣本間的交叉污染。結合使用細胞計數儀能大幅縮短計數時間，提高工作效率。

其他器材

• 使用校準過的移液器以確保取樣體積準確
• 使用低吸附槍頭和離心管以避免細胞和溶液掛壁

看完了今天的分享，小伙伴們是不是對細胞計數有了更深的了解？當有人向你提出諸如“用血球計數板數1x10^5/ml濃度的樣本時CV也必須達到5%以下”的“無理要求”時，你知道該怎樣用科學的態度予以回應了吧？如果你仍心有疑慮，或對方依舊不服，歡迎留言或致電021-58860038，Nexcelom的應用科學家們會非常樂意和大家繼續探討這個有趣的話題。

參考文獻

1.Student. On the Error of Counting with a Haemacytometer. Biometrika 1907; 5(3): 351-60.

2.Shapiro HM. "Cellular Astronomy" - A Foreseeable Future in Cytometry. Cytometry Part A 2004; 60A:115-24.

3.Freund M, Carol B. Factors Affecting Haemocytometer Counts of Sperm Concentration in Human Semen. Journal of Reproductive Fertility 1964; 8: 149-55.