新蛋白質交聯抗體的標記和修飾使用方法
介紹
現在的研究中，一個大生物分子與另一個大分子的共價結合，如抗體與酶或酶與DNA的共價結合，仍是研究人員實驗中的重點之一。其中有幾種方法可用于交聯兩個生物分子。一種常見的方法是使用一種小分子交聯劑（如Sulfo-SMCC）。SMCC的一端有胺反應性NHS酯基與蛋白質的游離胺（-NH2）反應，另一端有巰基反應性馬來酰亞胺基與要結合的生物分子的巰基（-SH）反應，從而形成綴合物。 蛋白質上的SMCC修飾的連接基極不穩定，并且經常自反應，因為蛋白質通常同時包含游離胺基和巰基，所以會導致大量的相同蛋白質發生交聯反應。 另外，蛋白質上馬來酰亞胺基團的數量的定量非常繁雜，而且很難確定兩個生物分子在反應中的適當摩爾比，以獲得理想的功能和綴合效率。
目前AAT Bioquest已經開發了一種方便有效的交聯方法以高綴合產率連接兩個生物分子。該方法使用兩種獨特的交聯劑（Buccutite MTA和Buccutite FOL），MTA和FOL在蛋白質上的交聯劑易于控制和定量。 在脫鹽柱上除去游離的連接物后，在溫和條件下混合，Buccutite MTA活化的抗體和BuccutiteFOL修飾的蛋白質。 純化基本上是不需要的，并且反應不會發生相同蛋白質交聯。
實驗材料
- 抗體和酶：山羊抗小鼠IgG和小鼠IgG來自Jackson Immuno Research Laboratories；HRP來自Calzyme，微管蛋白小鼠mAb來自Life Technologies。
- 純化柱：所有純化柱均為Bio-Rad的Bio-Spin尺寸柱。
- 細胞成像：HeLa細胞用4％甲醛固定，并用Mouse Anti-tubulin染色，然后用HRP-山羊-抗小鼠IgG綴合物染色。最后用Olympus IX71熒光顯微鏡拍攝圖像。
綴合原理
- 用MTA激活山羊抗小鼠IgG，并用FOL修飾蛋白（APC或PE）（1小時）。
- 活化的IgG和修飾的蛋白用旋轉柱純化（5分鐘）。
- 將激活的抗體和修飾的蛋白混合（30分鐘）。
- 用所需的綴合物染色細胞，無需進一步純化。
圖1. Buccutite 抗體-蛋白質綴合過程。
結果
用于ELISA檢測的Buccutite HRP-IgG綴合物
圖2.通過使用Buccutite 交聯方法（紅色）和SMCC方法（藍色）制備HRP-山羊-抗小鼠IgG綴合物生成的ELISA曲線圖。將小鼠單克隆抗體（100 ng）包被在96孔板上，用標準方法將GAM IgG-HRP綴合物稀釋2倍。然后使用ABTS底物溶液（＃11001，AAT Bioquest）孵育30分鐘，檢測固定的小鼠IgG，并在405 nm處讀數。
用于細胞成像的Buccutite IgG-RPE綴合物
圖3.微管蛋白在HeLa細胞中使用RPE-山羊-抗小鼠IgG綴合物染色的熒光圖像。用小鼠抗α-微管蛋白抗體將微管蛋白染色，并用如上所述的Buccutite 交聯方法制備紅色熒光RPE-山羊-抗小鼠IgG綴合物，最后在顯微鏡下觀察。
染料說明
- 交聯劑非常穩定，Buccutite 交聯反應試劑激活的大分子非常穩定，可以在4ºC下保存超過24個月。
- 綴合條件非常簡單，Buccutite 綴合物可以在很寬的pH值、濃度和溫度下實驗，且不需要催化劑。
- 高效，Buccutite 綴合可在1小時內完成。在相同條件下，與其他現有方法相比，Buccutite 綴合反應具有更高的效率。綴合可以在極低的濃度下進行。
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