Inscopix系列的大腦超微鈣成像系統一般用在嚙齒類動物身上的居多，因為設備體積小，重量輕，且在實驗時動物可以自由活動而成像質量不受影響，因此受到了很多神經科學研究者的青睞。
 
但在最近的一篇來自Inscopix公司和美國德克薩斯大學奧斯汀分校的研究人員在bioRxiv上發表的文章則描述了inscopix nVista頭戴式顯微鈣成像設備應用在獼猴身上的研究，該研究將兩個inscopix鈣成像設備埋植在獼猴左右兩側的大腦上，對采集到的鈣離子活動信號通過數學模型的分析解碼，實現了將神經信號與行為動作的解讀關聯。實驗方法并不復雜，并且還實現在清醒可自由動作的靈長類動物上。下面我們對這篇文章的實驗及分析過程進行介紹。
 
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文章首先對在獼猴頭上安裝頭戴式微型顯微內窺鏡的手術操作進行了講解，手術環節分為兩個部分，第一是將病毒注射到感興趣的大腦區域以表達經過基因編輯的鈣指示蛋白，第二個是將長期型內窺透鏡植入到目標位置（圖1）。
 
對于獼猴皮質中表達鈣指示蛋白，他們采用了兩種基于AAV的略（圖1B），一種是使用傳統AAV表達實現基于GCaMP的鈣成像，第二種是將兩種病毒混合在一起構成AAV Tet-Off病毒系統。與常規策略相比，該系統可在較短時間內表達較高水平的GCaMP，它的GCaMP表達是TET依賴的，因此對動物施用強力霉素可暫時抑制GCaMP的表達，這對于在長期成像中防止發生過度表達很重要。經過試驗，這兩種方法均可在皮質中產生足夠的GCaMP6f表達，并在皮質各個位置均有充分分布。觀察表達GCaMP的細胞的形態，發現在CaMK2a病毒參與下，蛋白表達偏向于興奮性錐體神經元；而在Tet-Off病毒系統下，則偏于泛神經元表達，這與以前的報道一致。與傳統只表達CaMK2a病毒相比，Tet-Off病毒系統在注射后的相同時間點可以觀察到更高的表達水平。
 
他們將成像區域定為大腦左右兩側的背外側運動前皮層（PMd）前肢區域，依靠實驗前掃描得到的猴腦MRI圖像以及標準解剖圖集對猴腦建立立體圖像以確定實驗坐標。在左半球的PMd，注入Tet-Off病毒系統的兩種病毒；在右半球PMd，注入AAV1.CaMK2a.GCaMP6f。實驗中對病毒注射位點拍照記錄，在顱骨上做基準點標記，并在硬腦膜切開處使用人工硬腦膜以防止切口處軟腦膜和蛛網膜上的心血管生成，這樣在后續埋植透鏡時能更準確地找到病毒注射位置。在腦中植入的是斜端面透鏡，植入位置在皮質下面2mm處，在猴顱骨上擰入骨螺釘，將埋入的透鏡，顯微鏡底座，以及一個定制的可以包住整個埋植透鏡的帶蓋腔室，一起用水泥/丙烯酸樹脂固定在頭骨上（圖1A）。由于顱骨切口完全用/丙烯酸樹脂密封，植入物感染風險低，幾乎不需要維護。一旦完成上述兩個手術步驟，就可以對動物進行鈣成像觀察記錄了。
 
 

   
 
細胞級別分辨率的鈣成像
 
透鏡植入手術后大約兩周就可以觀察細胞鈣活動。這種頭戴式微型顯微鏡和植入設計的主要優勢在于，它操作簡單，插上顯微鏡即可觀察。放置顯微鏡時，猴子可舒適的坐在工學設計的標準靈長類動物椅子上，頭部被暫時限制活動以完成微型顯微鏡對接，將軟墊靠在猴頭側面，將腔蓋拿開，取下微型鏡底板上的保護蓋，將微型鏡對接至底板，擰緊固定螺釘，不到2分鐘即可完成整個操作，然后放開動物頭部開始成像。
 
在透鏡植入兩周后進行的第一個成像過程中，研究人員觀察到了表達GCaMP的細胞和相應的細胞鈣活動，實驗猴進行伸手任務，成像觀察4周后，活動細胞數量開始上升并達到相對穩定的值（圖1C-F）。成像過程中，動物頭部完全不受約束，可自由移動和咀嚼食物。盡管實驗動物的下頜，頭部和身體有明顯的運動，但成像視野還是非常穩定的，僅通過標準的剛性平動校正算法就可在整個記錄過程中精確記錄幀。實驗期間，在所有記錄的視頻幀中，應用校正值的中位數為0.75μm，比成像細胞的平均大小要小一個數量級。運動校正后，頭部運動與視野平移之間的微小誤差可以完全緩解。
 
數據分析使用了CNMFe（constrained nonnegative matrix factorization，一種用于從單光子微內窺鏡鈣成像數據中識別細胞的常用算法）來識別單個細胞并提取其細胞鈣活動。在展示的左半球記錄示例中，算法確定了106個單細胞（圖1C-D）。鈣事件具有足以通過標準事件檢測算法的信噪比，且鈣離子活動符合預期的典型模式，有快速上升和指數衰減的特性（圖1E）。在這個記錄里（圖1F），整個神經元群中測到的信噪比和事件發生率均與在嚙齒動物模型的鈣成像研究中通常觀察到結果相似。右半球PMd的成像細胞明顯減少，可能是由于透鏡相對于表達GCaMP的細胞區域的放置位置不是最佳。但從這些細胞中檢測到的鈣事件與從左半球細胞中觀察到的信噪比和事件發生率是相似的。
 
 
在長期鈣活動記錄中追蹤單個神經元群
 
研究人員在不到8個月中一共進行了66次成像記錄，在開始4個月中連續進行了42次記錄（圖2A），之后暫停。動物全身注射熒光染料以進行鎮靜血流成像，經一個月后，恢復了鈣活動成像，但血液熒光染料完全干擾了檢測GCaMP熒光信號的能力。研究人員在第6個月繼續進行鈣成像，測試Dox給藥對測得的鈣活動的影響。從第0天到第76天的32個成像階段中（圖2A），結果令人滿意，總體成像質量和鈣活動保持穩定（圖2B-C）。左半球PMd中識別出的細胞數在間隔的記錄之間波動，但總體相對穩定，記錄細胞中位數為104個 [四分位數IQR 91-113] （圖2B）。信噪比和檢出鈣事件率在各試驗記錄中也是相對穩定的，在右半球PMd的成像細胞中也觀察到了相似的穩定性（圖2C）。
 
比較左右半球細胞群在整個實驗過程中的鈣事件衰減，發現左半球的衰減明顯比右半球慢，這在兩個半球的SNR參數相同的情況下，表明左半球高表達GCaMP的細胞數量比右半球多，這也與組織學結果一致，表明在注射后的相同時間點，Tet-Off病毒系統會產生比常規CaMK2a病毒策略更高水平的表達。鑒于GCaMP過度表達會引發癲癇和細胞毒性，因此對于長期成像實驗而言，將表達水平保持在合理范圍內非常重要。研究人員另外測試了Dox給藥對測得的鈣動力學的影響。如預期的那樣，Dox的使用導致GCaMP表達水平顯著降低。使用Dox 8天后停用3天，鑒定出的細胞數量從75減少到0，施加Dox還會加快鈣事件的衰減。停用Dox大約40天后，整個視野的平均熒光，鑒定的細胞數量和熒光衰減都恢復到Dox之前的水平。在第一次記錄算起的第8個月進行的成像記錄中，成像質量，鈣動力學和事件發生率與前4個月記錄的結果相當。這些結果表明，Tet-Off病毒策略表達GCaMP可在長達數月的長期成像中將指示蛋白表達維持在可接受水平內。
 
 

   
 
因為實驗中的成像質量和鈣活動檢測的整體穩定性比較好，研究人員嘗試追蹤單個神經元，這是鈣成像相比電生理的主要優勢。對兩個在不同時間點記錄的鈣活動錄像，他們首先用CNMFe提取兩次記錄中的細胞圖，記錄細胞位置，這樣每個細胞就有相對于其他細胞的相對位置（圖2D）。通過計算兩組數據中的關聯位置，檢測推算其中的相同細胞。空間相關性分數高于閾值的細胞對被推定為相同細胞。對于圖示的記錄匹配，實驗方法能夠將第29天成像的細胞中的63％識別為第36天成像的相同細胞。在對所有成像進行計算后，在最小間隔1-4天的記錄中，有中值約為70％的細胞可確認為同一細胞，在間隔67-73天的記錄中，有約40％為同一細胞（圖2E）。進一步嘗試是否可以通過多個連續的成像記錄而不是簡單地通過任何兩個記錄來追蹤相同神經元。實驗研究了7個成像記錄的集合，跨越大約3周時間，應用自定義縱向匹配算法（圖2F），在多個成像記錄中跟蹤相同的神經元，發現有68個細胞只在一個記錄里活躍，有17個細胞7個記錄里都活躍。這些結果證實了這種成像方法可以在數月的時間里對活動獼猴腦中大量神經元鈣活動進行成像，且成像質量具有足夠的穩定性，可以長時間縱向追蹤單個神經元。
 
 
綜合神經元鈣活動，解碼自然伸手動作
 
接下來，研究人員將神經元的鈣離子活動與動物動作進行直接關聯。首先訓練動物的伸手動作，在動物面前有左右兩個位置，隨機交替放置食物獎勵，動物伸手取食（圖3A）。根據先前的電生理實驗研究，預期是在動物伸出左手或右手時，其神經元活動對其伸手方向有選擇性活躍，對側手臂活動對神經活動有響應。實驗結果證實了期望，在圖表展示的左半球記錄中，動物正用右臂伸手，幾個神經元在向區域1和區域2伸手期間，鈣離子活動均有增加且發生鈣事件的可能性更高，其他細胞則表現出對伸手到區域1相比區域2有更多的鈣活動，反之亦然。圖表的三個示例清楚地展示了神經元獨特的選擇傾向（圖3B），無論是鈣事件還是在鈣離子活動變化上。
 
在示例記錄里可觀察到，整個成像細胞群體的鈣活動變化與伸手動作調節的多樣性，大多數細胞表現出與一個或兩個伸手方向相關的活躍變化（圖3C）。研究人員計算了一個調整指數，來捕捉每個細胞在整個細胞群中對伸手方向的選擇性程度（圖3D）。實驗完成后，他們用該指數將細胞分為1區選擇性，2區選擇性和非選擇性細胞，發現在78個細胞中有35個為選擇性細胞，1區占20％，2區占17％。他們將這種方法應用每個記錄中，發現在不同記錄中存在相同比例細胞對區域1和區域2有選擇性（圖3E）。將所有記錄里的細胞用該指數分類，然后將經過分類細胞的分布重新映射到大腦的成像視野里，評估PMd是否在空間上組織了伸手方向的選擇性（圖3F）。在這些選擇性映射圖中，沒有發現任何明顯的空間組織。為了測試具有類似選擇性的細胞是否傾向于分布位置更靠近一些，研究人員計算了一個聚類指標，即最鄰近細胞具有相似選擇性的頻率。度量值顯著大于0.5表明類似選擇性細胞群集。對于圖3F中所示的記錄，聚類指標為0.57，但與0.5沒有顯著差異。本研究中使用的GRIN斜端面透鏡允許同時成像散布在多個皮質層上的細胞。在評估了方向選擇性細胞所占比例與特定皮質層的關系后結果發現，在視野內皮質的全部深度上，具選擇性細胞的比例相當均勻。
 
 

   
 
考慮到所記錄的細胞群中對伸手位置選擇性的鈣活動，研究人員猜想是否可以用細胞群體鈣活動經多次試驗來逐步解碼動物伸手方向。使用偏最小二乘判別分析和留一法交叉驗證，從400 ms（幀長度100 ms）記錄里所有被識別細胞的連續鈣活動變化中解碼伸手方向（圖3G）。解碼結果的準確率遠大于隨機水平，并在手進入相應選擇區域時達到峰值。不同記錄之間的解碼準確性保持穩定。盡管相對于連續鈣活動記錄，鈣事件數據量較少，但基于鈣事件解碼的準確性也大大超過隨機概率（圖3G）。如同預期，解碼精度取決于訓練解碼器所用的信元數量，即便只有一個訓練信元，準確性依然高于隨機水平。
 
 
跟蹤隨時間變化的細胞群體鈣離子活動與動物行為之間的關系
 
已經確定猴腦左右半球PMd神經元鈣離子活動均表現出對伸手方向具有選擇性（圖3），并驗證了鈣成像方法跨時間縱向跟蹤神經元群的能力（圖2），研究人員接下來研究單個神經元的方向選擇性隨時間推移的變化或保持穩定的程度。他們將分析重點放在了左半球的部分記錄上，在這部分記錄里動物完成了足夠數量的伸手試驗，跨2個星期，進行了5次記錄（圖4A）。圖示記錄中，已在空間上標定了它們的細胞映射，并推定了82個同一細胞（圖4A），然后比較兩個記錄里同一細胞的調整指數，觀察到顯著的相關性，且總體調整指數沒有變化（圖4B）。時間間隔增加后，兩個記錄之間調整指數的相關性仍然很高，調整指數變化仍然很低，這表明PMd細胞經過2周時間仍具有穩定的方向選擇性（圖4C）。
 
 

   
根據跨時間追蹤細胞測得的總體調整指數相對穩定，研究人員預測，用特定記錄的鈣活動變化訓練解碼器，然后對記錄自其他時間點的鈣離子活動進行解碼也會表現得相當好。示例的兩個記錄，在對原記錄和跨一天記錄的測試中，解碼精度均遠高于隨機水平（圖4D）。把記錄間隔時間加長，大多數情況下，峰值解碼精度仍高于隨機水平（圖4E），這表明PMd對伸手方向的編碼在幾天到幾周內相對穩定。對這些神經元的縱向跟蹤增進了我們對神經活動與行為之間動力學關系的理解。
 
 
背外側運動前皮質多個部位的雙側鈣離子成像
 
迄今得到的結果分別來自左半球或右半球PMd，而動物伸展手臂在記錄半球對側。在第20天到第76天的記錄中，研究人員還同時從兩個半球成像（圖5）。由于微型鏡的體積小，頭部上有足夠的空間來安裝兩個微型鏡，如果研究有需要甚至可以容納更多的鏡頭。為了利用雙邊成像功能，首先對動物進行訓練，使其執行類似前述實驗的動作，只不過訓練動物用右臂伸到區域1，用左臂伸到區域2（圖5A）。這樣與左右半球PMd的同時記錄相結合，使他們能夠在逐次試驗的基礎上研究手臂伸張如何在大腦兩側進行編碼的。
 
實驗證明左右半球均有同側或對側伸手選擇性的細胞鈣活動（圖5B-C）。在圖5所示的雙邊記錄中，有些細胞在同側伸手和對側伸手時均有增加的鈣活動，有些細胞在對側伸手時鈣離子更加活躍，有些則在同側伸手時鈣離子更加活躍。每個半球的三個示例清楚展示了這些選擇性（圖5B）。研究人員在雙邊成像的細胞群中觀察到了大量與伸手相關的鈣離子活動調節差異（圖5C）。大多數細胞顯示出與對側伸手有關的顯著活動調節，但仍有少數細胞對同側伸手敏感。
 
 

   
 
鑒于在兩個半球記錄中的神經元對同側和對側伸手均存在選擇性，研究人員嘗試是否可以使用雙側整體的細胞鈣活動來解碼發出動作的手臂身份。如前所述，他們采用留一法交叉驗證的模型，以100毫秒幀的400毫秒幻燈片連續鈣活動來解碼左臂或右臂動作。在此示例記錄中，解碼精度遠高于隨機，并在進入區域時達到峰值（圖5D）。峰值解碼精度在整個記錄中穩定（圖5E）。這些結果證實了同步多點成像的可行，并給出了初步數據，應用這些功能加深了我們對雙邊編碼伸手動作的理解。
 
 
參考文獻：
Anil Bollimunta, Samantha R. Santacruz, Ryan W. Eaton, Pei S. Xu, John H. Morrison, Karen A. Moxon, Jose M. Carmena, Jonathan J. Nassi. Head-mounted microendoscopic calcium imaging in dorsal premotor cortex of behaving rhesus macaque. 
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.04.10.996116v1
 
Inscopix的nVista™和nVoke™解決方案在世界重要刊物上已發表100多篇文章，使科學家們對大腦有了更深刻的認識，進而描繪出動物自由活動時大腦清晰活躍的神經網絡。