mRNA純化之后的文庫構建通常有兩種思路，一種是先用oligo（dT）引物反轉錄mRNA，再進行cDNA的片段化，另外一種則是先將mRNA打斷，再結合隨機引物進行反轉錄。
 

1.先用oligo（dT）引物反轉錄mRNA，再進行cDNA的片段化：此方法先得到長片段的cDNA，反轉成雙鏈cDNA之后再利用DNA片段化的方法進行片段化（酶切法或機械法），得到片段化dsDNA之后的建庫方法與DNA建庫方法完全一致。
 

2.先將mRNA打斷，再結合隨機引物進行反轉錄：此方法中的mRNA打斷方法包括堿處理法、金屬離子（Mg2+、Zn2+）溶液處理法、酶（RNaseIII）處理法，mRNA片段化之后應立即進行一鏈cDNA合成，因為mRNA在該體系下非常容易降解。選擇金屬離子（Mg2+、Zn2+）溶液處理法打斷時需根據需要的文庫片段大小選擇合適的打斷溫度和時間。（一般設置為150-200bp 94°C，15 min； 200-300bp 94°C，10 min； 250-550 bp 94°C，5 min）

先針對mRNA進行打斷再進行反轉錄獲得測序reads主要是針對基因本體的；若先反轉錄，尤其是結合oligo(dT)進行反轉錄獲得的測reads對轉錄本3'端具有比較強的偏好性，所以在mRNA-Seq中建議采用先對mRNA打斷再進行反轉錄的文庫構建方法。