（ 一） 前言

哮喘、 克羅恩病和高血壓是分別影響氣管、 腸道和血管的慢性疾病， 都和管狀器官的過
度收縮有關。 為使氣道或血管收縮， 平滑肌細胞（ smooth muscle cells， SM cells） 之間
會通過互相聯系， 產生連接通路進行力的傳遞， 引起器官的收縮反應。 目前， 我們對此連接
通路的機制知之甚少。

2018 年， 美國東北大學和哈佛醫學院的學者們利用法國 Alveole 公司的 PRIOM“ 定制
化細胞微環境制備系統” 創建了 2 個平滑肌細胞的互相作用模型， 對細胞-細胞連接通路和
細胞-細胞外基質（ ECM） 連接通路進行了研究， 取得了一系列的成果【 1】 ：

結論 1： ECM 的剛度是一個開關， 當它達到某一個值的時候， 平滑肌力通過 ECM 傳導，
在這個值以下的時候， 通過細胞-細胞間連接傳導。

結論 2： 隨著 ECM 剛度的增加， 粘附連接（ adherens junctions)和黏著斑連接（ focal
adhesions） 的熒光圖像顯示， 細胞-細胞間界限逐漸消失， 粘附連接減少， 而黏著斑連接出
現。

結論 3： 在相同的 ECM 剛度下， ECM 傳導的收縮力也大于細胞-細胞間連接傳導的收縮力。
這些成果有助于對哮喘和高血壓等疾病的進一步研究。

（ 二） 實驗設計

2.1 為什么要用 Alveole PRIMO？

要研究 ECM 剛度和 SM 細胞間力的傳遞的關系， 就要創建一個 SM 細胞模型， 具有可調節
剛度的基質， 并能度量細胞-細胞之間， 和細胞-ECM 之間的作用力。 傳統方法設計的細胞模
型缺點很多： 如分辨率不夠、 設計不靈活、 很難對材質進行功能化改造、 耗時長、 人工操作
繁瑣， 等。 因此， 科學家選擇了創新型的全自動的 Alveole PRIMO“ 定制化細胞微環境制備
系統” 來創建這個細胞作用力模型； 并通過改變 ECM 剛度， 檢測“ 細胞收縮力” ； 確定“ 粘
附連接” 和“ 黏著斑連接” 之間轉換的 ECM 剛度數值。

2.2 用 PRIMO 進行細胞模型設計

科學家用 PRIMO 在二甲基硅氧烷（ PDMS） 基質上設計了一個長方形的明膠塊， 再在上面
種植了 2 個相鄰的氣道平滑肌（ ASM） 細胞形成作用力模型。
科學家精心挑選了 NuSil 作為 PDMS， 關鍵是因為這種透明無孔的材料的剛度可以在
E=300Pa-40kPa 間調整。 NuSil 剛度 E=300Pa 時可以模擬健康人氣管的 ECM， 而 E=13kPa 和
E=40kPa 時用來模擬改造后的 ECM。 改變 NuSil 剛度， 就可以模擬不同剛度的 ECM， 從而判
斷 ECM 剛度和收縮力傳導通路間的關系。

實驗方法采取的是： 基質的表面功能化（ Micropatterning） ， 步驟如圖 1 所示： 圖 1. 用 PRIMO 進行 Micropatterning 的實驗過程：
圖 A、 圖 B： 將 NuSil 旋轉涂布在玻璃蓋玻片上， 在其表面創造出一層均勻的 NuSil 凝膠層。
圖 C： NuSil 材料在 60℃下烘烤過夜， 重復以上步驟在 NuSil 上加上一層薄的均勻的熒光微
珠層。
圖 D、 圖 E： 接上聚-L-賴氨酸（PLL） 和 mPEG-SVA， 后者在 PLL 上形成酰胺基團， 阻止細胞
粘附在 PLL 上。
圖 F： 加入光引發劑 PLPP， 用 PRIMO 投射 UV 光（λ =375nm） 到 NuSil 凝膠的表面， 快速降解暴露在 UV 光下的 PLL-PEG 覆蓋層， 產生一個 15µm× 150µm 的長方形微圖案。
圖 G： 將其與 0.1%明膠（加上 ECM 蛋白） 孵育 1h， 用 PBS 洗滌后， 明膠僅僅保留在長方形
微圖案區域。
圖 H： 生成的長方形的帶熒光的明膠圖案。

最后， 涂布 ECM 蛋白的 NuSil 凝膠在紫外滅菌后種上“原代人氣管平滑肌細胞” （HASMCs） ，
細胞僅粘附在微圖案上， 形成互相接觸的 2 個細胞的作用力模型。

2.3 實驗控制變量及設計

“基質剛度” 調節： NuSil 凝膠由 A 部分和 B 部分原料混合得到， B 部分（交聯劑） 的
占比可調節最終的基質的剛度（在 Young’ s modulus E=300Pa-40kPa 范圍內） 。
“細胞收縮力” 檢測： NuSil 表面涂布的熒光微珠的直徑是 1µm， 通過顯微鏡觀察熒光
微珠的運動， 用傅里葉牽引力顯微術（Fourier Traction Force Microscopy） 和 MATLAB
軟件程序計算得到細胞收縮力大小。
“粘附連接” 和“黏著斑連接” 的觀察： β -連環蛋白（β -catenin） 是細胞-細胞間
粘附連接（adherens junctions)的標志物， 可染成紅色； 而黏著斑蛋白（vinculin） 是細
胞-ECM 間黏著斑連接（focal adhesions） 的標志物， 可染成綠色。 細胞用 4%甲醛固定后，
同時針對β -連環蛋白和黏著斑蛋白進行染色， 用熒光成像觀察這兩種標志物蛋白， 從而判
斷細胞間連接的類型（圖 2） 。

在相同基質剛度下， “細胞-細胞間有無連接” 會影響“收縮時刻” ： “有連接的細胞
對” 用圖 1 方法創建， “相鄰又無連接的細胞組合” ： 建立新的細胞模型： 在微圖案上只種
上一顆單獨的細胞， 再把這兩個微圖案同方向連接在一起， 細胞間相鄰卻無相互作用。 將“細
胞對” 和“細胞組合” 的收縮時刻（contractile moment）（可理解為收縮力度， contractile
strength） 進行對比。

（三） 實驗結果及討論

3.1 “ 粘附連接” 和“ 黏著斑連接” 的觀察

在細胞水平， 平滑肌（ SM） 細胞可通過鈣粘蛋白（ cadherin） 介導的粘附連接和臨近的
細胞直接聯系； 它們也可以通過整聯蛋白（ integrin） 介導的黏著斑連接和 ECM 作用， 通過
ECM 和遠距離的其他 SM 細胞進行間接的聯系。



圖 2-1.“ 粘附連接” 和“ 黏著斑連接” 的觀察：

圖 A： 剛度為 E=300Pa 的 NuSil 基質可用來模擬健康的人氣管的細胞外基質（ ECM） ， 此時
ASM 細胞交界處清楚地顯示紅色的β -連環蛋白（ 細胞-細胞間粘附連接（ adherens junction)
的標志物， 紅色） ， 說明形成穩定的細胞-細胞連接。

圖 B： 模擬重新建模的剛性更強的 ECM， E =13kPa-40kPa， 當 ECM 剛性增強到 13kPa 時， 可以看出細胞交界處出現了綠色的黏著斑蛋白（ 細胞-ECM 間黏著斑連接(focal adhesion)的
標志物， 綠色， 黃色箭頭） ， 說明出現細胞-ECM 連接。

圖 C： 當 ECM 剛性增強到 40kPa 時， 細胞交界處的β -連環蛋白（ 紅色） 完全讓位給了黏著
斑蛋白（ 綠色， 黃色箭頭） ， 說明平滑肌力從“ 細胞-細胞之間傳導” 變成了“ 通過 ECM 傳
導” 。 兩個細胞完全分開。 圖 2-2. 圖 D： Y 軸是被黏著斑連接（ 綠色） 占據的面積， 隨基質剛度增加而增加， 說明“ 通
過 ECM 傳導” 的通路連接增加。
圖 E： Y 軸是被粘附連接（ 紅色） 占據的面積， 隨基質剛度增加而減少， 說明“ 通過細胞-
細胞之間傳導” 的通路連接減少。

科學家發現， 粘附連接區域的減少總是伴隨著黏著斑連接區域的增加。

3.2 “細胞-細胞間有無連接” 影響“收縮時刻”

收縮時刻表示的是收縮力度， “有連接的細胞對” 間存在粘附連接， 而“相鄰又無連接
的細胞組合” 間只存在與 ECM 的黏著斑連接。 實驗結果表明： 即使在相同的基質剛度下， 細
胞-ECM 間黏著斑連接的收縮力度也要高于細胞-細胞間粘附連接的收縮力度； 細胞-細胞間
連接極大地減少了 SM 細胞的整體的收縮力（圖略） 。 隨著基質剛度增加， 粘附連接減弱，
每個 ASM 細胞與 ECM 的作用增強， 收縮時刻（收縮力度） 也明顯增加。

3.3 其他實驗結果

其他實驗結果包括： 隨著基質剛度的增加， ASM 細胞對的收縮時刻（收縮力度） 增加；
ASM 細胞對連接部位的牽引力增加； 細胞-細胞間作用力強度（Ψ） 減弱（圖略） 。

3.4 實驗展望

目前的實驗結果是細胞種類依賴性的， 如心肌細胞就有不同的結論（細胞-細胞間作用
隨基質剛性增加而增加） 。 本文只研究了 2 個平滑肌細胞在收縮刺激下的反應， 后續科學家
還會進一步研究其在同時有收縮刺激和舒張刺激下的反應， 和多個平滑肌細胞的相互作用，
更好地模擬體內生理環境。

（四） 關于 Alveole PRIMO

4.1 PRIMO 的運行原理
  圖 3. 左圖： 選擇電腦中任意一張圖案， 在 LEONARDO 軟件作用下， 用 PRIMO 進行非接觸式、
無掩模 UV 投射和蝕刻。 PRIMO 模塊和大多數倒置顯微鏡兼容。 右圖： PRIMO 通過控制 DMD
（Digital Micromirror Device） ， 即 DLP chip 的微型鏡片的開合狀態， 控制投射在細胞
基質上的紫外激光的照射強度、 照射時間和照射區域， 按照圖案進行靈活蝕刻【2】 。
PRIMO 的 Micropatterning 的實驗原理可參考： 生物建模的黑科技——快捷精準的“定
制化細胞微環境制備系統” （上） 。

4.2 PRIMO 的主要特點和優勢 ：

 無掩模： 非接觸式、 無掩模 UV 投射成像（波長λ =375nm） ， 可靈活控制 UV 的強度、 照
射時間、 區域；
 自動化： 全自動快速定制， 可針對實驗條件進行快速優化；
 高靈活性： 可按照任意圖案去構建您的基質和/或使其功能化， 不限圖案的大小和復雜
程度， 生成不同的細胞模型；
 多樣性/兼容性： 適用于常規的細胞培養基質， 基質可為平面或有微結構， 可硬可軟，
如： 玻璃蓋玻片、 塑料培養皿、 聚二甲基硅氧烷（PDMS） 、 聚苯乙烯、 水凝膠（PEG 丙
烯酸酯、 聚丙烯酰胺凝膠、 瓊脂、 基質膠） 、 光刻膠， 等；
 常 用 蛋 白 ： 我 們 的 客 戶 日 常 使 用 超 過 10 種 的 各 類 蛋 白 ： Fibrinogen-488,
Fibrinogen-647, Fibronectin, GFP, Neutravidin-488, Neutravidin-647,
PLL-PEG-Biotin, Protein A-647, Streptavidin, 初級和次級抗體， 等；
 高分辨率： 全視野分辨率為 1.2µm（500× 300µm ， 20 倍物鏡） ；
 多層次： 可蝕刻 256 個灰階層次， 粘附不同密度層次的蛋白；
 多種蛋白： 可應用 3 種不同蛋白（根據實驗需求） ；
 自動對齊： 自動進行檢測和圖案定位， 可自動對齊于微結構或者微圖案上；
 速度快： 蝕刻 500× 300µm 圖案， 20 倍物鏡， 僅需 30s。
PRIMO 強大的生物建模能力和對細胞微環境的控制， 可以為多種生物學實驗帶來全新
的、 突破性視角， 可用于研究細胞遷移/趨觸性、 細胞黏附、 2D/3D 細胞標準化培養、 細胞
球培養、 生物力學、 組織工程、 微流體等多個領域。

（五） 附錄

更多資訊， 請聯系： 森西科技有限公司， 電話： 010-61666616， 熱線: 400-687-6366，
郵箱： info@sinsitech.com， 網址： www.sinsitech.com。 掃描以下二維碼， 關注微信公眾
號， 獲得更多信息：