前面我們介紹了熒光指示劑法可以將Ca2+檢測的實驗與其他技術結合使用，如可以與流式細胞儀、熒光分光光度計、或者熒光顯微鏡進行聯合檢測 。紫外光型主要包括Quin-2、Indo-1、Fura-2等，數量較少，可見光型數目較多，包括Fluo-3、鈣黃綠素、Rhod-2等。

熒光指示劑根據測光原理和數據處理的性質又可以分為比值型和非比值型兩種類型。其中Fura-2、Benzothiaza、Indo-1和BTC等系列屬于比值型,化學熒光指示劑大都為非比值型染料。

雖然比值型熒光染料較少，但應用廣泛，下面介紹幾種典型的熒光染料的特點：Fura-2 屬于雙波長激發指示劑，其激發特性與Ca2+濃度有關，當介質中沒有Ca2+時，其激發峰為380nm，當與鈣結合時，激發峰向短波方向340nm處移動，最后分別以340nm、380nm激發,得到發射光的比例，這種比例與細胞內Ca2+濃度成正比例的關系，這種染料可以減少染料負載，增強結果的準確性。Fura-2與雙波長顯微熒光分光光度計聯用可以測量單細胞內Ca2+的濃度，與流式細胞儀聯用可以測定細胞懸液的Ca2+的濃度 ，與熒光分光光度計聯用測量單細胞內及細胞懸液鈣離子的濃度，因為其結果準確，而且不易被漂白，所以是廣泛使用的指示劑。

Indo-1也是一種雙波長發射指示劑，單波長激發（340nm）和雙波長發射（405nm和506nm）,也可以用熒光比率來反應細胞內Ca2+的濃度。它的優點與Fura-2相似，但其漂白作用明顯，應用時應該盡量減小狹縫寬度和盡量減少激發光照射時間。 目前最新的熒光指示劑是第三代熒光指示劑Fluo-3,是典型的單波長指示劑，激發波長位于可見光范圍內。最大吸收峰位于506 nm,最大發射波長是526 nm，Fluo-3與Ca2+結合后其熒光強度比游離時高出40倍左右，從而避免了細胞自身的熒光干擾，作為長波長指示劑，Fluo-3可以用作激光共聚焦成像研究，或者與其他熒光指示劑

Fura-2和Indo-1的熒光檢測

在適當的條件下通過監測比值型熒光指示劑的波長變化與細胞內游離的Ca 2+濃度的變化關系來檢測Ca 2+濃度是一項出色的技術，我們可以通過觀察Fura-2在300 nm至400 nm之間的吸收位移來檢測鈣離子濃度（同時以約510 nm的固定發射波長）。同樣，Indo-1可以被流式細胞儀的氬離子激光器（〜350 nm）很好地激發，當與細胞內游離的Ca2+結合時，Indo-1的發射波長從〜475 nm轉變為〜400 nm。Fura-2和Indo-1的熒光發射的一個關鍵特征是分別在〜360 nm和〜460 nm處存在一個等位點（圖1）。此時，兩個比值型指示劑的熒光強度均對游離Ca 2+的濃度不敏感。另外，等位點的存在預示了正確的實驗室操作，因為其他離子的污染或錯誤的移液會導致等位點的缺少。

圖1. 在含有0-39μM游離Ca 2+的溶液中，Fura-2的熒光激發光譜（上）和Indo-1的發射光譜（下）。

Fura-2和Indo-1衍生物：

AM 酯：比值型指示器的活細胞加載
Fura-2和Indo-1比值型指示劑可以以AM酯形式用于活細胞上樣，用AM酯標記比值型指示劑有助于其在活細胞完整細胞膜上的被動擴散，一旦進入細胞，非特異性細胞內酯酶就會水解AM酯，從而激活Ca 2+敏感指示劑。

Fura-2和Indo-1：鹽衍生物

Fura-2和Indo-1也可以作為細胞不滲透鹽衍生物使用以下方程式確定細胞質中游離Ca 2+的濃度：

[Ca 2+ ] free  = K d [F-F min ] / [F max  -F]

公式中各字母代表：

• K d是指示劑的Ca 2+解離常數
• F是實驗水平下Ca 2+指示劑的熒光值
• F min是在不存在Ca 2+的情況下觀察到的指示劑的熒光值
• F max是Ca 2+飽和情況下指示劑的熒光值。

與校準溶液相比，比例指示劑與Ca 2+結合光譜性質在不同細胞環境中差異很大。細胞內指示劑的原位校準產生的K d值通常明顯高于體外測定的K d值，在離子載體存在下將加載的細胞暴露于已知濃度的Ca 2+緩沖液中進行原位校準，其中離子載體用于提高細胞內Ca 2+的水平，在K d表1列出了一些鈣比例指標的值。

AAT Bioquest開發了Fura -8TM比值型指示劑，以AM酯和鹽衍生物形式提供，可改善對細胞內鈣濃度的敏感響應。與Fura-2相比，Fura-8 TM具有更高的信噪比，同時保持了對Ca 2+的相似親和力（圖2）。Fura-8 TM的顯著優點是其吸收和發射波長在紅色光譜方向上移動。Fura-8 TM可以在〜365 nm（與Ca 2+結合）和410 nm（無Ca 2 +）波長下激發，發射波長〜525 nm。這樣的光譜特性使Fura-8 TM可通過相對便宜的大功率LED激發，并與常見的發射濾波器組（例如FITC）兼容。此外，Fura-8 TM激發波長的變化使其可與在360 nm以下激發時會發出熒光的有機化合物一起使用，這可能導致錯誤信號。當使用Fura-8 TM時, 我們建議使用Ex / Em = 354/530 nm和415/530 nm進行比值測量。圖2.分別用Fura-2，AM（Cat＃21020）和Fura-8 TM，AM（Cat＃21055）測量的CHO-K1細胞中的ATP劑量反應。將CHO-K1細胞以40,000個細胞/ 100μL/孔在黑壁/透明底部96孔板中過夜接種。將細胞分別與Fura-2，AM或Fura-8，AM鈣測定染料上樣溶液孵育1小時。

美國AAT Bioquest Inc.(前身是ABD Bioquest，Inc.)是一家為從事生命科學研究、診斷研發及藥物開發的科學家研發、生產和銷售生物分析研究試劑和試劑盒的公司。公司致力于光譜學檢測領域，包括吸收（顏色），熒光和發光技術。AAT Bioquest的產品幫助全世界的科學家和生物醫藥研究者更好的了解生物化學，免疫學，細胞生物學和分子生物學等領域。AAT Bioquest會不斷介紹新產品，快速的豐富各個領域的產品。

作為AAT Bioquest Inc.的中國區域代理，艾美捷科技為中國客戶提供光譜學檢測領域，包括吸收（顏色），熒光和發光技術等全系列解決方案。我們也將一如既往更加努力為國內用戶提供快捷、方便的高質量產品，同時更為您售前售后全面技術支持。