Q1: 什么是噬菌體展示技術？
A1:噬菌體展示技術(phage display technology)是將多肽或蛋白質的編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，在閱讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，使外源多肽或蛋白與外殼蛋白融合表達，融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨立的空間結構和生物活性，以利于靶分子的識別和結合。肽庫與固相上的靶蛋白分子經過一定時間孵育后，洗去未結合的游離噬菌體，然后以競爭受體或酸洗脫下與靶分子結合吸附的噬菌體，洗脫的噬菌體感染宿主細胞后經繁殖擴增，進行下一輪洗脫，經過3輪～5輪的“吸附-洗脫-擴增”后，與靶分子特異結合的噬菌體得到高度富集。所得的噬菌體制劑可用來做進一步富集有期望結合特性的目標噬菌體。
 

Q2: 噬菌體展示與其他的抗體開發(fā)技術相比有什么優(yōu)點？
A2: 與雜交瘤技術相比，噬菌體展示技術具有很大的優(yōu)勢。雜交瘤法僅適用于小鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠。另一方面，噬菌體展示可用于包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、雞、駱駝、駱駝、羊駝、牛、狗、綿羊、猴和鯊魚在內的所有流行的抗體產生物種產生高親和力單克隆抗體。基于雜交瘤的單克隆抗體開發(fā)一次只能產生少量針對特定免疫原的抗體，而噬菌體展示技術可以呈現免疫動物的整個抗體庫，其中幾乎10%的抗體是免疫原特異性。使用噬菌體展示技術發(fā)現具有所需性質的抗體的機會要大得多。此外，使用雜交瘤技術，很難結合能夠選擇性分離具有所需功能的抗體的富集步驟。在大多數情況下，首先產生所有的雜交瘤克隆，然后逐個驗證。相比之下，噬菌體展示技術允許各種富集策略：可以富集具有所需性質的抗體，從而可以將那些沒有所需功能的抗體排除在進一步驗證之外。例如，抗體庫篩選可以使用靶捕獲強結合物同時使用控制來阻斷/耗盡交叉反應結合物。總之，這種免疫抗體庫方法允許收集動物體內幾乎所有的抗體，并從收集物中分離出最強的結合物。
 

Q3: M13、T7和T4噬菌體系列的區(qū)別是什么？
A3: M13絲狀噬菌體一直是最流行的選擇，廣泛用于各種類型的研究。病毒外殼由五個不同的衣殼蛋白組成，包括一個主要衣殼pVIII（2,700拷貝）和四個次要衣殼（一端是pIII和pVI，另一端是pVII和pIX）。與T4和T7不同的是，M13是溶原性噬菌體，它在周質中組裝，在不裂解宿主的情況下從細菌膜中分泌出來。M13噬菌體上的多重衣殼蛋白為具有獨特特性的多種肽和蛋白質提供了全面的展示選擇。這五種衣殼都已成功地用于具有獨特載體的外域顯示。PIII和PVIII是M13噬菌體展示的首要選擇。
噬菌體T4在許多方面不同于M13，T4具有更大的尺寸，尾部結構和編碼50種不同蛋白質的雙鏈DNA（dsDNA）基因組，較大的基因組DNA允許更大的外來蛋白的插入。可以在HOC和SOC上顯示兩個不同的結構域，這兩種非必需的外殼蛋白。可以使用N-和C-末端插入。在沒有膜分泌過程的情況下，使用T4噬菌體可以避免宿主毒性。
與絲狀噬菌體和λ噬菌體相比，T7噬菌體的生命周期較短。子代噬菌體的組裝在細菌細胞質中，通過細胞膜裂解而釋放，因此沒有大小限制和分泌過程導致的宿主毒性。此外，T7噬菌體在其他噬菌體不能存活的極端條件下非常穩(wěn)定。
 

Q4: 可以用M13噬菌體展示系統(tǒng)來構建cDNA文庫嗎？
A4: 通常M13不適合cDNA表達，因為M13噬菌體展示需要前導序列（分泌所需）和外殼蛋白pIII或pVIII的N末端之間的框內表達。為了將相應的蛋白質適當地融合到外殼蛋白中，插入物必須在兩端的正確閱讀框中并且不包含框內終止密碼子。這導致M13 cDNA文庫中產生的克隆數量極少。
 

Q5: 培養(yǎng)噬菌體可以用什么培養(yǎng)基？
A5: TSB / TSA可用于培養(yǎng)大部分噬菌體。然而，不同的噬菌體展示系統(tǒng)，適合的培養(yǎng)基可以是各種各樣的。
 

Q6: 噬菌體M13可以感染哪種大腸桿菌？ 它是否有機會污染我們實驗室中的所有細胞株？
A6: M13噬菌體是一種絲狀噬菌體，它使用細菌F接合菌毛的尖端作為受體來促進感染過程。因此，它們僅對含有F質粒（F+）的大腸桿菌菌株具有特異性。對于實驗室中的菌株，我們建議您檢查它們是否含有F質粒。如果他們不具有，M13噬菌體就不能感染它們。
 

Q7: 大腸桿菌TG1宿主菌是否含有抗生素抗性？
A7: 大腸桿菌TG1菌株不含抗生素耐藥性，而噬菌體感染的TG1菌株可通過2YT-AK培養(yǎng)基（2YT含100μg/mL氨芐青霉素、50μg/mL卡那霉素）篩選。
 

Q8: PFU和CFU的區(qū)別？
A8: pfu，指菌斑形成單位，是衡量單個感染性粒子數量的單位，通常用于計算噬菌體。cfu，指的是集落形成單位，是活細胞的量度，其中集落代表源自單個祖細胞的細胞集合，并且通常用于計數細菌（例如大腸桿菌）。
 

Q9: 怎么判斷構建的噬菌體文庫的優(yōu)劣？
A9：從免疫文庫中選擇的抗體親和力與文庫的大小成正比，文庫庫容越大，抗體親和力越好。通常，最終庫容的大小應該達到10⁸。它足夠大以分離高親和力抗體。此外，作為一個優(yōu)質文庫，它應該具有高度的多樣性。最終文庫的QC結果表明，所有隨機挑選的克隆均未發(fā)現共同的序列，表明文庫的多樣性處于很高的水平。