胡桃源性成分核酸檢測試劑盒（一管式PCR-熒光探針法）使用說明書
胡桃源性成分核酸檢測試劑盒（一管式PCR-熒光探針法）
◆ 產品說明
物種鑒定系列中的過敏原鑒定試劑，可針對食品中過敏原成分的特異核酸片段進行擴增，通過實時擴增曲線判定結果。本產品用于食品原料或加工食品中過敏原胡桃成分的檢測，檢出限為0.01%。
◆ 產品組成（96測試）
|
022102LⅡ |
|
|
試劑 |
含量 |
|
A-胡桃源-P |
20μL × 8管× 12排 |
|
NG-P |
100μL × 3支 |
|
PG-胡桃源-P |
100μL × 2支 |
- 適用儀器
ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600等實時熒光PCR儀。
◆ 自備耗材和儀器
①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；③離心機；④渦旋混勻器；⑤金屬浴。
◆ 注意事項
1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實驗要分區操作。
1）第一區：樣本制備區。
2）第二區：模板添加區。
3）第三區：擴增及產物分析區。
★ 分區之間最好進行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。
2．實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區域獨立使用工具，需更換手套和實驗服。
3．嚴格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴格按照說明書要求在冰盒上操作。
4．反應液中的成分對光敏感，應避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應避免反復凍融，推薦使用前離心30秒，并按檢測頻次將反應液以適當體積分管保存。
5．反應結束后，擴增管請置于密封袋內丟棄，當日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。
6．不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內使用。
◆樣品處理
參照《SN/T 1961.6-2013 出口食品過敏原成分檢測 第6部分：實時熒光PCR方法檢測胡桃成分》或其他標準處理樣品，制備的樣本保存待用。
樣品的采集和制備是過敏原成分鑒別的重要步驟，防止交叉污染的措施按照GB/T 27403中的規定執行。
詳細步驟請按照標準操作或查閱食安通軟件。
◆ 實驗操作
1.模板制備（樣本制備區）
建議使用配套動物基因組DNA提取試劑盒，具體過程詳見產品說明書。
2.添加模板（模板添加區，放置于冰盒上進行）
剪下所需測試數的已含有反應液的PCR管，放置在室溫待解凍后，離心30秒后揭開封口膜，向每管反應液中分別加入5μL模板，順序為NG、待測樣品模板、PG-胡桃源-P。蓋好配套的PCR管蓋后，渦旋混勻30s，離心1min，立即進行PCR擴增反應。
3.擴增反應（擴增及產物分析區）
使用熒光定量PCR儀，熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇TAMRA。
按下列條件設置擴增反應：
|
PCR循環 |
熒光收集位點 |
||
|
50℃ |
2分鐘 |
1個循環 |
— |
|
95℃ |
15分鐘 |
1個循環 |
— |
|
95℃ |
15秒 |
40個循環 |
— |
|
60℃ |
1分鐘 |
※ |
|
4.基線和閾值設定
基線調整取3-15個循環的熒光信號，閾值線應超過陰性對照擴增曲線的最高點。
◆ 結果判定
檢測樣品Ct值≤35，則判定為被檢樣品陽性，檢出過敏原胡桃成分。
檢測樣品Ct值≥40，則判定為被檢樣品陰性，未檢出過敏原胡桃成分。
檢測樣品35＜Ct值＜40，則重復一次。如再次擴增后Ct值仍為＜40.0，則判定為被檢樣品陽性，檢出過敏原胡桃成分。如再次擴增后Ct值≥40，則判定為被檢樣品陰性，未檢出過敏原胡桃成分。
- NG反應為平滑直線，PG反應為“S”型擴增曲線，此次檢測結果有效，否則無效。如重復檢測結果仍為無效，請與技術支持人員聯系。
