油菜內(nèi)源基因核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法SN標(biāo)準(zhǔn)）使用說明
油菜內(nèi)源基因核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法SN標(biāo)準(zhǔn)）
◆ 產(chǎn)品說明
轉(zhuǎn)基因檢測系列可針對食品、飼料等樣品中轉(zhuǎn)基因成分的特異核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增，通過實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。本產(chǎn)品用于油菜成分的檢測，檢出限為0.1%。
◆ 產(chǎn)品組成（ 48測試）
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045032M | |
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試劑 |
含量 |
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A-PEP-P |
1000μL × 1支 |
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NG-P |
100μL × 1支 |
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PG-PEP-P |
100μL × 1支 |
◆ 適用儀器
熒光PCR儀（ABI 7500，CFX 96，Mx 3005P，LineGene9600）等PCR擴(kuò)增儀。
◆ 自備耗材和儀器
①滅菌1.5mL或2.0mL離心管；②滅菌0.2mL PCR管或八聯(lián)管；③冰盒；④移液器（11-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；⑤離心機(jī)；⑥渦旋混勻器；⑦金屬浴；⑧均質(zhì)機(jī)、攪拌機(jī)或研缽等研磨器具；⑨電子天平。
◆ 注意事項(xiàng)
1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實(shí)驗(yàn)要分區(qū)操作。
1）第一區(qū)：試劑準(zhǔn)備區(qū)。
2）第二區(qū)：樣本制備區(qū)。
3）第三區(qū)：擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)。
★ 分區(qū)之間最好進(jìn)行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。
2. 實(shí)驗(yàn)過程中穿戴工作服和乳膠手套，使用移液器，試驗(yàn)產(chǎn)生的所有廢棄物及時(shí)處理。
3．嚴(yán)格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴(yán)格按照說明書要求在冰上操作。
4．反應(yīng)液中的成分對光敏感，應(yīng)避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應(yīng)避免反復(fù)凍融，推薦使用前離心30秒，并按檢測頻次將反應(yīng)液以適當(dāng)體積分管保存。
5．反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增管請置于密封袋內(nèi)丟棄，當(dāng)日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。
6．不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內(nèi)使用。
◆ 樣品處理
參照《GB/T 19495.3-2004 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測 核酸提取純化方法》或其他標(biāo)準(zhǔn)處理樣品，制備的樣本保存待用。
詳細(xì)步驟請按照標(biāo)準(zhǔn)操作或查閱食安通軟件。
◆ 實(shí)驗(yàn)操作
將試劑完全解凍，各組分離心30s。
1. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)，放置于冰盒中進(jìn)行）：
若有N個(gè)待檢樣品，則參照下表，按照N+2個(gè)數(shù)量計(jì)算反應(yīng)液用量（N個(gè)待檢樣品+1個(gè)陰性對照+1個(gè)陽性對照），渦旋混勻，離心30s，分裝于0.2mL PCR管中。
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試劑 |
使用量 |
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A-PEP-P |
20×(N+2)μL |
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反應(yīng)液總體積 |
20×(N+2)μL |
- 模板制備（樣本制備區(qū)）
建議使用配套植物基因組DNA提取系列產(chǎn)品，具體過程詳見產(chǎn)品說明書。
3．添加模板（樣本制備區(qū)，放置于冰盒中進(jìn)行）
在步驟1中已含有反應(yīng)液的PCR管中分別加入5μL模板，順序?yàn)镹G-P、待測樣品模板、PG-PEP-P。渦旋混勻30s，離心1min，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
4. 擴(kuò)增反應(yīng)（擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)）
使用熒光定量PCR儀，熒光基團(tuán)選擇FAM，淬滅基團(tuán)選擇TAMRA。
按下列條件設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)：
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PCR循環(huán) |
熒光收集位點(diǎn) | ||
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95℃ |
10分鐘 |
1個(gè)循環(huán) |
— |
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95℃ |
15秒 |
40個(gè)循環(huán) |
— |
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60℃ |
1分鐘 |
※ | |
6.基線和閾值設(shè)定
基線調(diào)整取3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號，閾值線應(yīng)超過陰性對照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)。
◆ 結(jié)果判定
檢測樣品無Ct值，曲線為直線或輕微斜線，無“S”型擴(kuò)增曲線，可報(bào)告樣品陰性，不含有玉米成分或含量低于檢測限；
檢測樣品Ct≤30，曲線呈“S”型擴(kuò)增曲線，可直接報(bào)告樣品陽性，含有油菜成分；
檢測樣品30<Ct≤40，需進(jìn)行一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若Ct值仍處于30和40之間且呈“S”型擴(kuò)增曲線，同時(shí)陰性對照無Ct值，報(bào)告樣品陽性，否則報(bào)告樣品陰性。
- NG反應(yīng)為平滑直線，PG反應(yīng)為“S”型擴(kuò)增曲線，此次檢測結(jié)果有效，否則無效。如重復(fù)檢測結(jié)果仍為無效，請與技術(shù)支持人員聯(lián)系。
