做elisa實驗需要注意哪些問題？

Elisa實驗中應(yīng)該注意的問題，包括樣品稀釋、試劑盒平衡、樣品和試劑的混勻、加樣、溫育等問題，希望對你有用處。 Elisa試劑盒有著準確性高、靈敏度高、特異性強的諸多優(yōu)點，深受廣大用戶朋友的喜愛。然而，在實驗過程中，也需要注意很多問題。對此，武漢福來生物工程提醒你，需要遵守一些規(guī)則，才能更好地進行實驗，取得較好的實驗成果。 Elisa方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測定。在Elisa測定中影響因素較多，在檢測過程中除正常反應(yīng)外，有時常見到一些錯誤的結(jié)果。引起ELISA測定錯誤結(jié)果的原因主要有：標本因素；試劑因素；操作因素。 1．樣品稀釋 一般產(chǎn)品的樣品稀釋倍數(shù)均通過大量試驗確定，以保證試驗的靈敏度和特異性。酶聯(lián)免疫反應(yīng)是一種敏感性很高的反應(yīng)，如果血清不稀釋，不可避免會產(chǎn)生很強的非特異性反應(yīng)，出現(xiàn)假陽性。 2．試劑盒平衡 Elisa中所有試劑和板條均應(yīng)在試驗前平衡至室溫(約25℃)，一般需在室溫放置20～30分鐘以上。平衡時間太短會造成試劑混勻不夠，樣品孵育時間相對縮短，ELISA反應(yīng)不夠充分。冬季室溫低，可將試劑盒置37℃溫箱20分鐘。 3．樣品和試劑的混勻 在稀釋前、后的樣品必須充分混勻，所有試劑在加樣前也須搖勻，以保證試驗的均一性。 4．加樣 加樣是一項很重要的步驟。加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附。 5．溫育 溫育是ELISA測定中影響測定成敗最為關(guān)鍵的一個因素。ELISA作為一種固相免疫測定，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原完全結(jié)合，必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時間。 6．洗板 固相免疫測定技術(shù)是一種非均相免疫測定技術(shù)，需以洗滌操作將特異結(jié)合于固相的抗原或抗體與反應(yīng)溫育過程中吸附的非特異成份分離開來，以保證ELISA測定的特異性。洗液盡量不要溢出孔外；加洗液后要靜置1分鐘，甩去板孔中洗液后，一定要大力拍干；及時更換吸水紙，尤其是拍過酶標記物的吸水紙一定要棄去，否則可能影響試驗結(jié)果。 7．顯色 顯色一定要控制時間,根據(jù)試劑盒說明操作即可。一般來說，顯色時間過短，結(jié)果偏低；顯色時間過長，空白增高或者非特異性顯色增加。 8．比色 比色要注意波長的選擇。以TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長為450nm，后者為492nm，濾光片需根據(jù)要求隨時更換。因此，容易出現(xiàn)濾光片錯用的問題。