Western，也稱Western blot、Western blotting、Western印跡，是用抗體檢測蛋白的重要方法之一。可按照以下步驟操作。
1.收集蛋白樣品(Protein sample preparation)
使用細胞裂解液，對貼壁細胞、懸浮細胞或組織樣品進行裂解。然后測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。

2. 電泳(Electrophoresis)
(1) SDS-PAGE凝膠配制
SDS-PAGE凝膠（分離膠及濃縮膠）可以參考一些文獻資料進行配制
 

(2) 樣品處理

   在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關文獻資料配制， 100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。

(3) 上樣與電泳
（1）冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內即可。 為了便于觀察電泳效果和轉膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，最好使用預染蛋白質分子量標準。

（2）電泳時通常推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍進入下層膠時使用高電壓恒壓電泳。對于Bio-Rad的標準電泳裝置 或類似電泳裝置，低電壓可以設置在80-100V，高電壓可以設置在120V左右。

（3）為了電泳方便起見，也可以采用整個SDS-PAGE過程恒壓的方式，通常把電壓設置在 100V，然后設定定時時間為90－120分鐘。設置定時可以避免經常發生的電泳過頭。通常電泳時溴酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據預染蛋白質分子量標準的電泳情況，預計目的蛋白已經被適 當分離后即可停止電泳。

3. 轉膜(Transfer)
（1）我們推薦在Western實驗中選用PVDF膜。硝酸纖維素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纖維素膜比較脆，在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。膜的使用請參考生產商的推薦使用步驟。通常如果使用Bio-Rad的標準濕式轉膜裝置，可以設定轉膜電流為300-400mA，轉膜時間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉膜過夜。具體的轉膜時間要根據目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大， 需要的轉膜時間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉膜時間越短。

（2）在轉膜過程中，特別是高電流快速轉膜時，通常會有非常嚴重的發熱現象，最好把轉膜槽放置在冰浴中進行轉膜。 轉膜的效果可以觀察所使用的預染蛋白質分子量標準，通常分子量最大的1-2條帶較難全部轉到膜上。轉膜的效果也可以用麗春 紅染色液對膜進行染色，以觀察實際的轉膜效果。也可以用考馬斯亮藍快速染色液對完成轉膜的SDS-PAGE膠進行染色，以觀察蛋白的殘留情況。

4. 封閉(Blocking)

 （1）轉膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預先準備好的Western洗滌液中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉膜液。從轉膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產生較高的背景。
 

（2）用微型臺式真空泵吸盡洗滌液，加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動,室溫封閉60分鐘。對于一些背景較高的抗體，可以在 4℃ 封閉過夜。
 

5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)

 （1）參考一抗的說明書，按照適當比例用Western一抗稀釋液稀釋一抗。

 （2）用微型臺式真空泵吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效果 不佳，可以在4℃緩慢搖動孵育過夜。

 （3）回收一抗。加入Western洗滌液，在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。

6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)

（1） 參考二抗的說明書，按照適當比例用Western二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗。

（2）用微型臺式真空泵吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。

（3）回收二抗。加入Western洗滌液，在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10分鐘。共洗滌 3次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。

7. 蛋白檢測(Detection of proteins)

（1） 參考相關說明書，可使用英格恩的Enlight等超敏ECL發光液來檢測蛋白。
（2）洗片時可以使用X光片自動洗片機。如果沒有自動洗片機，可以用顯影定影試劑盒自行配制顯影液和定影液進行手工洗片。

8. 膜的重復利用(Membrane recovery)

 如果蛋白樣品非常寶貴，可以使用Western一抗二抗去除液處理蛋白膜，以重復利用蛋白膜