【蛋白研究系列專題】-13丨ELISA的真真假假

ELISA被廣泛應用于農業、養殖業、食品安全、臨床診斷等領域，是一種靈敏度高、特異性強、操作簡便的檢測方法。在實際應用中，ELISA操作的各方面均對結果產生影響，如移液器的使用、樣本存放、加樣、溶血、試劑溫度、避光等。除此之外，一些非主觀因素也會對結果造成較大偏差。

ELISA實驗中的假陰性和假陽性結果，讓各位實驗君頭都大了吧？欲哭無淚吧？今天，小編和各位一起分享下假陰性、假陽性的原因及解決辦法。

假陰性

①標本用肝素或EDTA等抗凝處理，易造成HBsAg檢測結果假陰性。肝素抗凝血漿會增加OD值,可能與高濃度肝素具有強大的負電荷，能吸附酶標記物不易洗脫有關。EDTA、酶抑制劑（如NaN₃）可抑制ELISA系統中的辣根過氧化物酶活性，造成假陰性。

肝素                        

②采用雙抗體夾心法測定抗原時，如果用一步法測定，而此時被測物濃度過高，則可能由于勾狀效應導致檢測結果為陰性。為避免這種情況可以對樣本進行稀釋，或者直接改用雙抗體夾心兩步法。

雙抗體夾心法               

③樣本內被測物的濃度較低，也易造成假陰性結果。比如某些疾病發展初期被檢物濃度低于檢測限。

④某些情況下，個別個體的基因突變也可能導致檢測結果為假陰性。尤其是檢測用抗體的結合位點在突變區的情況下，這種情況雖然極其罕見，但是也可能存在的。

假陽性

假陽性的出現通常是樣本中摻雜有同源或同工物質，例如類風濕因子、補體、交叉反應物質和其它物質等。

類風濕因子              

①血液樣本處理時，如有溶血會使樣本中具有弱過氧化物酶活性的亞鐵血紅素催化底物四甲基聯苯胺（TMB）顯色，產生假陽性結果。因此，在處理ELISA最常檢查的血清樣本時，要注意凝集過程、離心過程等細節，避免出現溶血和摻雜血細胞。

②RF（一種能結合多種動物IgG Fc的自身IgM抗體）可與酶標二抗Fc結合造成假陽性。為避免這種情況，在檢測抗原時可加入2-巰基乙醇使RF降解，或用熱變性IgG（63℃，10 min）進行封閉處理。另外，使用F(ab)₂替代完整的IgG也可達到目的。一些其他的嗜靶抗原自身抗體，如抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素球蛋白等在檢測時，可能與靶抗原結合形成復合物，干擾測定結果。所以在測定前需用理化方法將其解離后再測定。

③補體一方面會使一抗和酶標二抗分子發生變構暴露出Fc段C1q分子結合位點，從而將二者連接起來造成假陽性。另一方面也可能會結合固相抗體從而封閉其與抗原的結合表位而造成假陰性。所以對細胞培養用血清、動物血清樣本進行56 ℃ 30 min的補體滅活是有必要的。另外，通過用EDTA稀釋樣本也可降低這種作用。

補體C1q                   

④樣本中存在的類地高辛、類AFP等物質能與抗原產生交叉反應。尤其在使用單抗測定抗原時，如果正好交叉反應的抗原決定簇是單抗結合位點時，會出現假陽性結果。

地高辛                      

⑤如樣本中因實驗處理或污染含有某些細菌，如表皮球菌，菌體釋放的內源性HRP可能會對檢測結果造成假陽性。

在ELISA檢測中為了避免出現假陰性或假陽性，不僅要嚴格執行標準操作規程，還要對與標本相關的各因素進行分析，采用對應措施排除干擾物質的干擾作用，做到檢測結果準確一致。