蛋白質(zhì)（Protein）是生物體中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物細(xì)胞，作為生命的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，蛋白質(zhì)在催化生命體內(nèi)各種反應(yīng)進(jìn)行、調(diào)節(jié)代謝、抵御外來物質(zhì)入侵及控制遺傳信息等方面都起著至關(guān)重要的作用，因此蛋白質(zhì)也是生命科學(xué)中極為重要的研究對象。

現(xiàn)代研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)越來越多的多肽同蛋白質(zhì)一樣具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽庫是現(xiàn)在的研究熱點(diǎn)之一。因此需要高效率、高靈敏度的肽和蛋白質(zhì)序列測定方法支持這些研究的進(jìn)行。現(xiàn)有的肽和蛋白質(zhì)測序方法包括N末端序列測定的化學(xué)方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化學(xué)降解法等，這些方法都存在一些缺陷。例如作為肽和蛋白質(zhì)序列測定標(biāo)準(zhǔn)方法的N末端氨基酸苯異硫氰酸酯 PITC分析法，測序速度較慢，通量低；樣品用量較大，對樣品純度要求很高；對于修飾氨基酸殘基往往會錯誤識別等。C末端化學(xué)降解測序法則由于無法找 到PITC這樣理想的化學(xué)探針，其發(fā)展仍面臨著很大的困難。在這種背景下，質(zhì)譜（Mass spectrometer）由于相對 較高的靈敏度、準(zhǔn)確性、易操作性、快速性及較好的普適性而倍受科學(xué)家的廣泛應(yīng)用。

蛋白的質(zhì)一級結(jié)構(gòu)式氨基酸序列，通過鑒定氨基酸序列來匹配它的蛋白質(zhì)，這是定性研究，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基礎(chǔ)。現(xiàn)在蛋白質(zhì)組學(xué)基本研究手段是：以生物質(zhì)譜技術(shù)為核心，對蛋白質(zhì)進(jìn) 行大規(guī)模、高通量分離、鑒定和分析。現(xiàn)代質(zhì)譜一般由離子源（Ion source）、質(zhì)量分析器（Mass analyzer）和離子檢測器（Detector）三部分組成。

在對簡單蛋白質(zhì)樣本，比如雙向凝膠（2D gel）蛋白質(zhì)點(diǎn)、單維膠（1D gel）切割下來的蛋白質(zhì)條帶（Band）以及純化蛋白等，均可選用離子源為電噴霧電離（ESI）或者基質(zhì)輔助激光解吸離子化（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI）的質(zhì)譜來進(jìn)行鑒定。ESI原理是在噴霧器頂端施加一個電場給微滴提供凈電荷，在高電場下，液滴表面產(chǎn)生高的電應(yīng)力，使表面被破壞產(chǎn)生微滴。荷電微滴中溶 劑的蒸發(fā)，微滴表面的離子“蒸發(fā)”到氣相中，進(jìn)入質(zhì)譜儀。MALDI的原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶 薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過程。

1. 如果選擇MALDI-TOFTOF進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定，需要提供多少樣品？ 

如果是考染的2D膠點(diǎn)或者是條帶，只要是肉眼可見均可保證一個比較好的成功率。或者提供大于200 fmol（或 10ng左右50kDa左右的蛋白質(zhì)）鑒定成功率也很高。如果是溶液或者是凍干樣品，蛋白質(zhì)含量至少需要100ng。

2.蛋白膠點(diǎn)鑒定時，2-DE采用銀染染色的方法，請問哪些銀染試劑會對后續(xù)的質(zhì)譜鑒定產(chǎn)生影響？ 

銀染試劑里不要使用戊二醛，因?yàn)樗鼤�對蛋白進(jìn)行修飾，這樣會影響后續(xù)的蛋白鑒定。該染色方法見與質(zhì)譜兼容銀染染色方法。

3.怎樣減少角蛋白的污染？

角蛋白的污染主要來自于頭發(fā)和皮屑，所以在實(shí)驗(yàn)和切膠過程中應(yīng)帶好手套和頭套。

4. 膠點(diǎn)需要合并嗎？

對于考染樣品只要肉眼可見一個膠點(diǎn)即可。銀染樣品建議4個單獨(dú)點(diǎn)合并，但一般情況下我們建議銀染樣品用

LC-MSMS進(jìn)行鑒定。

5. 關(guān)于樣品保存時間問題？ 

我們推薦是新鮮制備的樣品馬上進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。銀染樣品的保存時間最好不好超過2個月，考染樣品可以保存幾個月以上，但是最好也不要超過6個月。

6. 接受已經(jīng)酶解的樣品嗎？除了Trypsin酶以外，會用其他的酶進(jìn)行酶解嗎？

我們不接收已經(jīng)酶解好的樣品，因?yàn)槲覀儍?nèi)部有嚴(yán)格的酶解QC控制，需要我們來操作酶解。一般情況下我們會選擇單一的Trypsin進(jìn)行酶解，如果需要其他的酶進(jìn)行酶解，請與我們提前聯(lián)系。

7. 小分子量蛋白怎么進(jìn)行鑒定？ 

一般如果分子量范圍在20kDa以上，我們推薦用MALDI-TOFTOF進(jìn)行鑒定；如果是20kDa以下，我們推薦用

LC-MSMS進(jìn)行鑒定。

8. 樣品寄送問題？

膠點(diǎn)或條帶樣品直接置入1.5mL EP管中（EP最好為進(jìn)口，如果沒有進(jìn)口可聯(lián)系我們，我們免費(fèi)寄送進(jìn)口EP管）， 在管蓋寫好樣品編號，管中不需要加任何液體，填好樣品等級表可常溫寄送。其他純化或凍干樣品，如果再常溫下穩(wěn)定的話可以常溫寄送，如果不穩(wěn)定建議干冰運(yùn)送。

9. 膠點(diǎn)鑒定結(jié)果與跑出的雙向蛋白圖譜比較，發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)得分最高的點(diǎn)分子量或等電點(diǎn)與圖譜上不對應(yīng)，相差 較大，請問在這種情況下，該如何判斷一個膠點(diǎn)中給出的幾個甚至十幾個點(diǎn)蛋白中哪個蛋白可信度最高？ 

蛋白質(zhì)譜鑒定是通過肽段歸并到蛋白，因此有些鑒定到的蛋白可能是目標(biāo)蛋白的同源蛋白或該蛋白的一亞基，而蛋白的人為或天然修飾、降解等情況都會影響該蛋白出現(xiàn)在膠圖中的位置。一般來講，Mascot鑒定得分越高，可信度 就越高，其次可以結(jié)合分子量、等電點(diǎn)、肽段覆蓋率等信息篩選可信度高的蛋白質(zhì)。