實驗設備

細胞培養設備(如培養瓶、多孔培養板、溫箱、顯微鏡、旋轉培養器等)、水浴箱等。

實驗步驟

1. 制備誘生劑：采用NDVF系弱毒株，以雞胚尿囊液形式保存于-20℃，

其血凝滴度穩定在1:640～1:1 280之間。大量繁殖時，用0.5%水解乳蛋白稀釋100～1 000倍，接種于9日齡雞胚尿囊腔，置37℃培養72h后，收獲尿囊液，效價測定應大于1:640，無菌檢查應合格。

2. 制備誘生細胞：無菌采取人外周血(多用人臍帶血，或血庫貯藏血)，置于含肝素的無菌瓶內，于4℃保存不超過24h，誘生細胞(白細胞)不單獨提取，以全血代替。

3. 制備粗制干擾素：

   1) 加誘生劑，按1ml抗凝全血加0.2ml誘生劑(即NDVF系尿囊液，其血凝滴度不低于1:640)；

   2) 加溫吸附，將加有誘生劑的抗凝全血置37℃水浴中1h，每隔15min晃動一次，使NDVF吸附于白細胞上。然后以1000r/min離心20min，棄上清，留沉淀物；

   3) 加營養液孵育誘生，按抗凝全血的1～2倍量加Eagle營養液于上述沉淀物中，混勻，置35～36℃溫箱內旋轉培養18～20h；

   4) 離心及酸處理，將上述培養物以2000r/min離心30min，取上清，以6mol/L鹽酸將其pH值調至2.0，置4℃冰箱5天滅活NDV；

   5) 中性化，經5天酸化后，再用6mol/L氫氧化鈉將pH值調至7.2～7.4，即為粗制干擾素。

4. 制備精品干擾素：

   1) KCNS沉淀，取上述粗制干擾素，加KCNS并用2mol/L HCl調pH值為3.5，然后以2 000r/min離心30min取沉淀；

   2) 酒精提取，將沉淀溶于95%酒精(預冷至-20℃)，用2mol/L NaOH調pH值為4.2，以2 000r/min離心30min取上清；用2mol/L HCl調pH值至3.5，離心后取上清，再將pH值調至5.6，離心后取上清，最后將pH值調至7.1，離心后取沉淀；

   3) 過碘酸鈉沉淀，將沉淀溶于PBS中，加過碘酸鈉，并調pH值為4.5，用50%乙醇10倍稀釋，離心后取上清，將上清液對0.3mol/L (NH4)2CO3(pH值7.6)在4℃下透析過夜。

   4) sephacryl S200柱層析：將sephacryl S200按要求處理后裝柱(4～5×100cm柱)，用PBS平衡后，加樣(即上述上清液)，用洗液洗脫。洗脫期間用核酸蛋白儀連續檢測，收集相應峰即為精制干擾素。取樣進行效價測定，按結果進行稀釋，分裝并凍干。

5. 檢定

   1) 效價測定

      a. 制備攻擊病毒：將水泡性口炎病毒(VSV)在雞胚成纖維母細胞上傳代后，

再在豬細胞(IBRS)上傳3～5代，使其對IBRS有良好致病效應，其TCID50應穩定(一般在10-6～10-7之間)。

      b. 準備測定細胞：生長良好的幼齡IBRS單層細胞。

      c. 測定：取上述單層細胞分為若干組，每組加不同稀釋度的干擾素，置37℃孵育20～24h，然后每管均用100個TCID50的VSV攻擊，置37℃ 48～72h孵育后，觀察結果。同時設細胞對照組和病毒對照組。病毒對照組CPE＞75%，正常細胞對照組CPE=0，即認為該測定系統有效。干擾素判定標準是以能保護半數細胞免受攻擊病毒損害的干擾素最高稀釋度的倒數作為干擾素的單位。

   2) 酸堿度測定

取本品10支，加水溶解，精密測量pH值應為6.0～7.5。

   3) 水分測定

按磺硫溶液法測定，不得超過3%。

   4) 安全試驗

取本品加水溶解，小鼠尾靜脈注射，48h內不得有死亡。

   5) 熱原檢查

取本品1支，加水溶解，依法檢查，應符合規定。

   6) 菌檢

取本品3支，無菌水溶解，分別接種到檢查需氧菌、厭氧菌及霉菌用培養基上，37℃培養1周，應無菌生長。

   7) 超敏反應

取健康豚鼠6只，每只腹腔注射本品適量，連續3次，于20天后再于耳靜泳注入本品適量，應無過敏反應現象發生。

注意事項

1. 制備NDVF系弱毒誘生劑時，種毒應無菌檢查合格，且滴度在1:640以上。收毒時，應將污染的雞胚棄去。

2. 不必從血液中將白細胞提取出來，因紅細胞對白細胞產生干擾素有營養作用。純化的白細胞產生干擾素效價不一定高。

3. 酸化的目的是殺死其中的誘生劑NDV，而在pH值20時，干擾素是穩定的。