作者：Suzanne kennedy 來源：美國MoBio實驗室【字號：大 中 小】

我們在產品研發過程中需要收集大量各種各樣的樣品，然后找出最佳的微生物DNA提取方法。所以當我們開發PowerLyer的操作流程的時候，希望能找到適合各種樣品的一套方法。我們之前在研究均質研磨和研磨珠套管的時候就知道，根據土壤類型不同選擇合適的研磨珠可以增加DNA的得率。所以我們決定使用PowerLyzer做一個類似的研究去回答一個問題：在強力珠磨研磨機上使用一樣的操作流程對不同類型土壤DNA得率和完整性結果是否一樣？很多人通過查閱參考文獻找他們一樣的土壤類型的提取方法流程，然后毫無優化改變地照搬。可是，一個提取方法能通用于所有類型土壤嗎？

在前面的文章《DNA提取 I：土壤的分子生物學特性》，我們對土壤的裂解均質有了全面的了解。今天，我用實例來回答這些問題。我們使用高速研磨機（PowerLyzer）對比了兩種不同類型土壤的DNA得率和完整性，其中一個粘土含量高，一個有機碳含量高；還加入了兩種不同研磨珠：0.1mm玻璃研磨珠（貨號13118）和0.7mm石榴石研磨珠（貨號13123）。結果很讓人驚訝。

研究方法:

我們收到了來自加利福利亞州立大學土壤研究中心的不同類型土壤樣品，并選擇了粘土含量差不多而有機碳含量有差異的兩種土壤。其中一種含粘土45%，有機碳2.5%；另一種含粘土40%，有機碳高達5%。有機碳含量越高，生物量越多，意味著最終DNA得率越高。

為了做對比實驗，選擇了PowerSoil DNA Isolation Kit的0.7mm石榴石研磨珠和PowerLyzer PowerSoil DNA Isolation kit的0.1mm的玻璃研磨珠。在PowerLyzer上從2000 RPM起到最大轉速5000RPM，做系列研磨試驗。每個樣研磨45s。

PowerSoil試劑盒提取的DNA用Nanodrop分光光度計測量含量，跑電泳檢查完整性。把玻璃研磨珠做的結果用藍色標記，石榴石研磨珠做的結果用紅色標記，做成下面的條形圖。

結果：

粘土，低有機碳含量土壤：

從第一個圖看得出來，高粘土含量土壤得率更高。我們可以看到玻璃研磨珠在3900-4200RPM的時候可以獲得最高DNA得率（條帶14、16）。很有趣的是，當研磨速度超過4200RPM時，得率不升反降。證明，對土壤樣品研磨過頭，反而會導致DNA的損失。就是說，獲得最高得率的DNA，有個研磨速度和時間上限。

我們還能看到，在低于3900RPM的時候，研磨珠和石榴石提兩種土壤樣品的DNA得率都差不多，為什么會出現這種情？

有個理論解釋說，土壤中含量兩種主要成分：容易被裂解的、很難被裂解的。低速研磨的時候兩種研磨珠都輕易磨開容易裂解的成分，而3900rpm的情況下玻璃研磨珠把另一個子集也裂解了。這部分可能是真菌和孢子。

可是，研磨太過的時候前面獲得的DNA就會被嚴重破壞降解，造成后面的低得率。

疏松高有機碳含量土壤

第二個圖是一個高有機碳含量的相似土壤做的一樣實驗。粘土成分高達40%，雖然沒有第一個樣品45%的粘土含量高卻得到不同的結果。

石榴石研磨珠、玻璃研磨珠在開始的時候DNA得率都差不多。但當到了3200-3500RPM以后，石榴石的表現則要好于玻璃研磨珠。可是在電泳上卻看到DNA破損相對嚴重一些。斷裂的DNA片段推高了OD值而會被誤以為得率升高。所以我們一直建議最好測OD的同時結合跑電泳評估檢查DNA。

還有很多原因導致OD值不能完全反映真實DNA得率，請看此文Popular Misconceptions about DNA Isolation and Quantification。

對于這種土壤類型，總的來說DNA得率還算高。使用石榴石研磨珠在一系列速度上都能獲得理想的DNA得率，并且在4200RPM達到峰值，往后得率不隨速度提高而增加。這些數據證明，速度和時間已經到達極限，不能提取到更多DNA了。

總結：

1- 上述數據告訴我們，土壤類型多樣，每種都有自己獨特的特性。沙灘砂土樣品的提取肯定跟森林土壤不一樣，每個粘土樣品之間可能會有差異性表現。土壤樣品質地的一致性、生物豐度不同、有機物含量不一等都會影響到最終你能獲得多少DNA和選擇的研磨方法。

2- 跑電泳結合測OD是最重要最常用的土壤DNA評估方法。使用PowerSoil DNA Isolation Kit提取土壤樣品，只會提取出來DNA，不帶任何RNA。市面上其它方法會連同RNA一起提取出總核酸，大大推高OD值，錯誤地以為提取過程很成功。可以通過跑電泳檢測DNA的完整性，從而知道研磨力度不夠還是有點過了。

3- 因為每個土壤類型都不一樣，有必要通過一系列不同速度、研磨時間，甚至采用不同類型研磨珠來做預實驗 。PowerSoil Kit我們建議從4000RPM 45s開始，因為這個速度和時間對于采用兩種不同研磨珠和大多數土壤類型樣品來說是最合適的。不過也許你想把速度調低或調高，取決于樣品中孢子含量和微生物豐度。嘗試不同速度做一系列實驗就能知道，你的樣品在哪個速度能獲得最多高質量DNA。

加利福利亞州立大學的Chris Kitts lab與我們共同參與了此項研究。該校學生完成了五個不同類型土壤分別用Vortex與PowerLyzer，石榴石研磨珠與玻璃研磨珠提取的DNA的t-RFLP分析。點擊查看相關海報。

最后，還是建議在啟動一個新的項目之前，用你的研磨機做一個線性速度研究。看看之前做土壤使用的實驗方案是否合適，對新樣品是否需要進一步優化。不同土壤特性獨一無二，前期多花點時間保障后面獲得寶貴數據是值得的。