DNA合成（DNA synthesis ）技術介紹
蛋白質概念提出：
DNA多肽合成（DNA synthesis ）：按照預定核苷酸的順序，將脫氧核苷酸逐個進行人工連接合成DNA鏈的方法。目前多是采用固相合成法，即是在多聚體支持物上從3′端延伸核苷酸，可自動化操作。)
目前，oligo DNA合成一般都采用固相亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，此方法具有高效、快速偶聯等優點，已在DNA化學合成中廣泛使用。DNA化學合成不同于酶促的DNA合成過程從5’®3’方向延伸，而是由3’端開始。
具體的反應步驟如下：
一、 保護基 (Deblocking): 用三氯乙酸 (Trichloroacetic Acid，TCA) 脫去連結在CPG (Controlled Pore Glass) 上的核苷酸的保護基團DMT (二甲氧基三苯甲基)，獲得游離的5’-羥基端，以供下一步縮合反應。
二、活化 (Activation): 將亞磷酰胺保護的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并進入合成柱，形成亞磷酰胺四唑活性中間體 (其3’-端已被活化，但5’-端仍受DMT保護)，此中間體將與GPG上的已脫保護基的核苷酸發生縮合反應。
三、連接 (Coupling): 亞磷酰胺四唑活性中間體遇到CPG上已脫保護基的核苷酸時，將與其5’-羥基發生親合反應，縮合并脫去四唑，此時合成的寡核苷酸鏈向前延長一個堿基。
四、封閉 (Capping): 縮合反應后，為了防止連在CPG上的未參與反應的5’-羥基在隨后的循環反應中被延伸，常通過乙酰化來封閉此端羥基，一般乙酰化試劑是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。
五、氧化 (Oxidation) :縮合反應時核苷酸單體是通過亞磷酯鍵與連在CPG上的寡核苷酸連接，而亞磷酯鍵不穩定，易被酸、堿水解，此時常用碘的四氫呋喃溶液將亞磷酰轉化為磷酸三酯，得到穩定的寡核苷酸。
經過以上五個步驟后，一個脫氧核苷酸就被連到CPG的核苷酸上，同樣再用三氯乙酸脫去新連上的脫氧核苷酸5’-羥基上的保護基團DMT后，重復以上的活化、連接、封閉、氧化過程即可得到DNA片段粗品。
最后對其進行切割、脫保護基 (一般對A、C堿基采用苯甲酰基保護；G堿基用異丁酰基保護；T堿基不必保護；亞磷酸用腈乙基保護)、純化 (常用的有HAP，PAGE，HPLC，C18，OPC等方法)、定量等合成后處理即可得到符合實驗要求的寡核苷酸片段。
上述方法多肽合成的Oligo在脫去保護基后，目的Oligo純度是極低的，其中含有大量的雜質。主要雜質有：所脫下的保護基與氨形成的苯甲酸氨和異丁酸氨，腈磷基上脫下的腈乙基，以及合成時產生的短鏈等。以至于粗產品中全長Oligo DNA含量僅為15%左右。盡管合成時每一步的效率都在97%~98%，但累積的效率并不高。以鏈長20mer和50mer為例，(97.5%)20»60%、(97.5%)50»28%。可見在粗產品中目的Oligo DNA含量很低，甚至10%都不到。這些雜質，尤其是存在于粗產品中的大量鹽和短鏈，不但造成定量不準，還會影響下一步的反應。因此必須對Oligo DNA進行純化。
目前在DNA合成儀上合成的Oligo DNA主要采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)方法進行純化。該方法純化的產品純度較高，可用于絕大部份的分子生物學實驗。若考慮節約經費，對于要求較低的實驗，如簡單的PCR反應，則采用脫鹽純化即可。
Oligo DNA是以OD260值來計量的。在1ml的1cm光程標準石英比色皿中，260nm波長下吸光度為1的Oligo溶液定義為1 OD260。雖然對于每種特定的寡核苷酸來說,其堿基的組成不盡相同，但1 OD260 Oligo DNA的重量約為33mg，每個堿基的平均分子量約為330 Da。因此合成的Oligo DNA摩爾數可按以下公式近似計算：摩爾數(mmol) = [OD值´33]/[堿基數´330] = 0.1´[OD值/堿基數]
DNA多肽合成（DNA synthesis ）：按照預定核苷酸的順序，將脫氧核苷酸逐個進行人工連接合成DNA鏈的方法。目前多是采用固相合成法，即是在多聚體支持物上從3′端延伸核苷酸，可自動化操作。)
目前，oligo DNA合成一般都采用固相亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，此方法具有高效、快速偶聯等優點，已在DNA化學合成中廣泛使用。DNA化學合成不同于酶促的DNA合成過程從5’®3’方向延伸，而是由3’端開始。
具體的反應步驟如下：
一、 保護基 (Deblocking): 用三氯乙酸 (Trichloroacetic Acid，TCA) 脫去連結在CPG (Controlled Pore Glass) 上的核苷酸的保護基團DMT (二甲氧基三苯甲基)，獲得游離的5’-羥基端，以供下一步縮合反應。
二、活化 (Activation): 將亞磷酰胺保護的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并進入合成柱，形成亞磷酰胺四唑活性中間體 (其3’-端已被活化，但5’-端仍受DMT保護)，此中間體將與GPG上的已脫保護基的核苷酸發生縮合反應。
三、連接 (Coupling): 亞磷酰胺四唑活性中間體遇到CPG上已脫保護基的核苷酸時，將與其5’-羥基發生親合反應，縮合并脫去四唑，此時合成的寡核苷酸鏈向前延長一個堿基。
四、封閉 (Capping): 縮合反應后，為了防止連在CPG上的未參與反應的5’-羥基在隨后的循環反應中被延伸，常通過乙酰化來封閉此端羥基，一般乙酰化試劑是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。
五、氧化 (Oxidation) :縮合反應時核苷酸單體是通過亞磷酯鍵與連在CPG上的寡核苷酸連接，而亞磷酯鍵不穩定，易被酸、堿水解，此時常用碘的四氫呋喃溶液將亞磷酰轉化為磷酸三酯，得到穩定的寡核苷酸。
經過以上五個步驟后，一個脫氧核苷酸就被連到CPG的核苷酸上，同樣再用三氯乙酸脫去新連上的脫氧核苷酸5’-羥基上的保護基團DMT后，重復以上的活化、連接、封閉、氧化過程即可得到DNA片段粗品。
最后對其進行切割、脫保護基 (一般對A、C堿基采用苯甲酰基保護；G堿基用異丁酰基保護；T堿基不必保護；亞磷酸用腈乙基保護)、純化 (常用的有HAP，PAGE，HPLC，C18，OPC等方法)、定量等合成后處理即可得到符合實驗要求的寡核苷酸片段。
上述方法多肽合成的Oligo在脫去保護基后，目的Oligo純度是極低的，其中含有大量的雜質。主要雜質有：所脫下的保護基與氨形成的苯甲酸氨和異丁酸氨，腈磷基上脫下的腈乙基，以及合成時產生的短鏈等。以至于粗產品中全長Oligo DNA含量僅為15%左右。盡管合成時每一步的效率都在97%~98%，但累積的效率并不高。以鏈長20mer和50mer為例，(97.5%)20»60%、(97.5%)50»28%。可見在粗產品中目的Oligo DNA含量很低，甚至10%都不到。這些雜質，尤其是存在于粗產品中的大量鹽和短鏈，不但造成定量不準，還會影響下一步的反應。因此必須對Oligo DNA進行純化。
目前在DNA合成儀上合成的Oligo DNA主要采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)方法進行純化。該方法純化的產品純度較高，可用于絕大部份的分子生物學實驗。若考慮節約經費，對于要求較低的實驗，如簡單的PCR反應，則采用脫鹽純化即可。
Oligo DNA是以OD260值來計量的。在1ml的1cm光程標準石英比色皿中，260nm波長下吸光度為1的Oligo溶液定義為1 OD260。雖然對于每種特定的寡核苷酸來說,其堿基的組成不盡相同，但1 OD260 Oligo DNA的重量約為33mg，每個堿基的平均分子量約為330 Da。因此合成的Oligo DNA摩爾數可按以下公式近似計算：摩爾數(mmol) = [OD值´33]/[堿基數´330] = 0.1´[OD值/堿基數]
標簽：
多肽合成 DNA
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