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轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品核酸水平檢測(cè)流程

瀏覽次數(shù):2517 發(fā)布日期:2014-10-30  來(lái)源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)
轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)流程介紹
轉(zhuǎn)基因食品問(wèn)題,一直以來(lái)都是充滿爭(zhēng)議的話題;如何科學(xué)正確地檢測(cè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品,成了政府檢測(cè)機(jī)構(gòu)及相關(guān)工作者高度關(guān)心的問(wèn)題。
轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的檢測(cè),就是檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中是否含有外源基因,即檢測(cè)啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因、目的基因、外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的豐度等。就方法而言,又分為基因水平的檢測(cè)和蛋白水平的檢測(cè)。
轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品核酸水平檢測(cè)的流程如下:
第一步:樣本前處理
稱取一定質(zhì)量的樣品,在研缽中研磨或用自動(dòng)組織勻漿儀處理,得到樣品粉末,同時(shí)使組織細(xì)胞破壁、釋放出核酸。
第二步:DNA提取純化
可以采用商業(yè)化DNA提取試劑盒,手動(dòng)或利用自動(dòng)核酸提取純化系統(tǒng)制備DNA模板,用于后續(xù)的PCR分析。
第三步:內(nèi)源基因的檢測(cè)
對(duì)物種內(nèi)源基因的PCR檢測(cè),主要用于驗(yàn)證DNA模板的提取質(zhì)量;
可采用普通PCR方法將目標(biāo)內(nèi)源基因擴(kuò)增后,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離,利用凝膠成像設(shè)備觀察分析是否有出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶;
也可通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法直接檢測(cè)目標(biāo)內(nèi)源基因的有無(wú)。
檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性表明從樣品中提取出適宜進(jìn)行檢測(cè)的DNA,可以進(jìn)行外源基因檢測(cè),否則應(yīng)重新進(jìn)行DNA提取和純化。
第四步:篩選基因檢測(cè)與品系鑒定檢測(cè)
對(duì)植物中轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè),先篩選檢測(cè)CaMV 35S、NOS、NPTII、PAT、BAR基因(啟動(dòng)子、終止子等等),確定是否含有外源基因;篩選結(jié)果陰性則直接報(bào)告結(jié)果;
若篩選結(jié)果陽(yáng)性,則需要進(jìn)一步鑒定檢測(cè)MON810、Bt11、Bt176、T14/T25、CBH351、GA21、TC1507、MON863、NK603、Bt10(結(jié)構(gòu)基因)的結(jié)構(gòu)特異性基因或品系特異性基因以確定是何種轉(zhuǎn)基因品系。
這兩個(gè)步驟均可通過(guò)普通PCR或者實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法完成。
第五步:確證實(shí)驗(yàn)
如果采用普通PCR方法檢測(cè)篩選基因與結(jié)構(gòu)特異性基因或品系特異性基因結(jié)果為陽(yáng)性,則需要通過(guò)采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行結(jié)果確證實(shí)驗(yàn)。
第六步:結(jié)果判斷與計(jì)算
待測(cè)樣品外源基因檢測(cè)Ct值≥40,內(nèi)源基因檢測(cè)Ct值≤24,對(duì)照正常,則可判定該樣品未檢出XXX基因;
待測(cè)樣品外源基因檢測(cè)Ct值≤36,內(nèi)源基因檢測(cè)Ct值≤24,對(duì)照結(jié)果正常,則可判定該樣品檢出XXX基因;
待測(cè)樣品外源基因檢測(cè)Ct值在36-40之間,應(yīng)重做實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。
定量計(jì)算:利用陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品與基因檢測(cè)Ct值,可以分別計(jì)算出外源基因與內(nèi)源基因序列拷貝數(shù),按照下列公式對(duì)轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行定量計(jì)算:

第七步:結(jié)果表述
定性結(jié)果表述:
對(duì)于X物種,未檢出轉(zhuǎn)基因成分;
對(duì)于X物種,檢出轉(zhuǎn)基因成分,(可進(jìn)一步報(bào)告)該樣品中含有XX轉(zhuǎn)基因品系。
定量結(jié)果表述:
未檢出轉(zhuǎn)基因成分,定量方法檢測(cè)限為X%;
樣品中XX轉(zhuǎn)基因成分低于本定量方法檢測(cè)限(X%);
樣品中所含XX轉(zhuǎn)基因成分為X%。
發(fā)布者:廣州皓博公司
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