轉基因植物的分子檢測與鑒定方法
隨著分子生物學和植物基因工程的不斷發展，越來越多的育種工作者開始利用轉基因技術獲得常規育種技術難以得到的新種質和新品種。植物轉基因技術最大的好處在于可以打破自然界物種間原有的生殖隔離，促進基因在不同物種間的交流，極大地豐富變異類型，增大遺傳多樣性，為植物新品種的培育提供豐富的育種資源。通過對基因功能的研究，篩選目的基因，還可實現植物性狀的定向改良。因此該技術自1983年首次獲得轉基因植物以來，便深受育種工作者青睞，得到了蓬勃地發展。至今已有30多科約200多種植物轉基因成功；國際上相繼有30多個國家批準3 000多例轉基因植物進入田間試驗，并且在美國、加拿大、中國等20多個國家成功進行了商品化生產。轉基因作物品種在農業生產中日益顯現出巨大潛力。
植物轉基因操作中，除利用抗生素抗性和除草劑抗性等選擇基因排除非轉化細胞而留存轉化細胞，以及利用Gus和GFP等報告基因顯示轉基因成功外，更重要的是從分子水平鑒別出陽性轉化體，明確目的基因在轉基因植株中的拷貝數和轉錄與表達情況。本文就常用的轉基因植株檢測與鑒定方法做一概述，并對近期發展起來的新方法做簡要介紹。
1.1.1 常規PCR
由于PCR檢測所需的DNA用量少，純度要求也不高，無需用同位素，實驗安全，操作簡單，檢測靈敏，效率高，成本低，使之成為當今轉基因檢測不可或缺的方法，被廣泛應用。然而，PCR檢測易出現假陽性結果。引物設計不合理，靶序列或擴增產物的交叉污染，外源DNA插入后的重排、變異等因素都會造成檢測的誤差。因此常規PCR的檢測結果通常僅作為轉基因植物初選的依據，有必要對PCR技術進行優化，并對PCR(real-time quantitative PCR)檢測為陽性的植株做進一步驗證。
1.1.2.1 多重PCR
1.1.2.2 降落PCR
1.1.2.3 rpPCR
1.1.2.4 反向PCR
1.1.2.5 實時定量PCR
1.2 Southern雜交
2 外源基因在轉化植株中是否轉錄的檢測與鑒定
2.1 Northern雜交
2.2 RT-PCR
Samia Djennane等把煙草硝酸還原酶基因Nia2經農桿菌介導導入馬鈴薯，經RT-PCR分析，Nia2基因在轉基因馬鈴薯體內RNA水平得到表達。
由于RT-PCR是在總RNA或mRNA水平上操作，檢測過程中必須注意RNA的降解和DNA的污染，另外還要設置嚴格的對照來防止假性結果的出現。
3 轉基因植株外源基因表達情況的檢測與鑒定
3.1 ELISA檢測
使用ELISA檢測外源基因表達蛋白具有便捷、靈敏、特異性好、試劑商業化程度高、成本低、適用范圍廣、試驗結果易讀等特點。但也存在易出現本底過高，缺乏標準化等問題。
3.2 western雜交
4轉基因植株檢測的其它技術
4.1 基因芯片技術
與常規技術相比，生物芯片技術的突出特點是高度并行性、多樣性、微型化及自動化。
4.2 試紙條技術
4.3 原位雜交技術
4.4 其它方法
綜上所述，轉基因植物的檢測方法有很多。PCR可以檢測目的基因是否整合在受體細胞的染色體上，但PCR檢測靈敏，易受DNA污染，同時對多位點插入難以檢測。檢測外源基因整合在植物染色體上最可靠的方法就是Southern雜交和原位雜交。Southern雜交可檢測外源基因插入的拷貝數和插入方式，是一種較為精確的分析，也是目前鑒定外源基因存在于轉基因植物中的權威方法；原位雜交是可以檢測外源基因存在的位置、整合外源基因的染色體及外源基因在該染色體上的位置。在外源基因的轉錄水平上，可用 Northern雜交和RT-PCR檢測。Northern雜交是研究轉基因植物中外源基因表達的重要方法，然而較煩瑣，而RT-PCR較之操作簡單，且更靈敏，特別是單拷貝時更常用。外源基因若編碼蛋白，在轉基因植物中表達蛋白的檢測可采用ELISA和Western雜交。用 Western雜交檢測外源基因是否表達，用ELISA則可做定量檢測，兩者常結合起來應用。
從轉基因植物的檢測技術來看，新技術不斷涌現，多種技術相互結合，互相補充，朝著高效、便捷、安全、自動化方向發展。
植物轉基因操作中，除利用抗生素抗性和除草劑抗性等選擇基因排除非轉化細胞而留存轉化細胞，以及利用Gus和GFP等報告基因顯示轉基因成功外，更重要的是從分子水平鑒別出陽性轉化體，明確目的基因在轉基因植株中的拷貝數和轉錄與表達情況。本文就常用的轉基因植株檢測與鑒定方法做一概述，并對近期發展起來的新方法做簡要介紹。
1 外源基因整合與否及其整合拷貝數的鑒定
1.1 PCR(polymerase chain reaction)檢測
1.1.1 常規PCR
PCR技術對目的片段的快速擴增實際上是一種在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下利用DNA聚合酶的酶促反應，通過3個溫度依賴性步驟(即變性、退火和延伸)完成的反復循環。經PCR擴增所得目的片段的特異性取決于引物與模板DNA間結合的特異性。根據外源基因序列設計出一對引物，通過PCR反應便可特異性地擴增出轉化植株基因組內外源基因的片段，而非轉化植株不被擴增，從而篩選出可能被轉化的植株。
由于PCR檢測所需的DNA用量少，純度要求也不高，無需用同位素，實驗安全，操作簡單，檢測靈敏，效率高，成本低，使之成為當今轉基因檢測不可或缺的方法，被廣泛應用。然而，PCR檢測易出現假陽性結果。引物設計不合理，靶序列或擴增產物的交叉污染，外源DNA插入后的重排、變異等因素都會造成檢測的誤差。因此常規PCR的檢測結果通常僅作為轉基因植物初選的依據，有必要對PCR技術進行優化，并對PCR(real-time quantitative PCR)檢測為陽性的植株做進一步驗證。
1.1.2 優化的PCR
PCR技術的優化目的在于提高擴增產物的特異性、推測目的基因的拷貝數及整合情況，從而提高檢測的效率。常見的有多重PCR(Multiplex PCR， MPCR)、降落PCR(Touchdown PCR，TD-PCR)、 rpPCR、反向PCR(inverse PCR，IPCR)、實時定量 PCR等。
1.1.2.1 多重PCR
MPCR是在同一管PCR反應體系中，使用多套針對多個DNA模板或同一模板的不同區域進行PCR擴增的方法。與普通PCR法相比，MPCR反應更快捷，更經濟，只需1次PCR反應，就能檢測多個靶基因。由于MPCR技術是在同一反應管中加多對引物同時對多個靶位點進行檢測，因此對引物的要求較高，不同引物間的相互干擾應降至最低；同時擴增的目的片段大小也不能太接近，否則凝膠電泳時難以分開，無法辨別。
1.1.2.2 降落PCR
TD-PCR是一種在一個反應管或少數幾個反應管中通過一系列退火溫度逐漸降低的反應循環來達到最佳擴增目的基因的PCR方案。它通過體系自身的代償功能彌補以反應體系和并非完美的循環參數所造成的不足。此策略保證了最初形成的引物模板雜交體具最強的特異性。盡管最后一些循環采用的退火溫度會降到非特異的Tm值，但此時的擴增產物已開始幾何擴增，在余下的循環中處于超過任何非特異性PCR產物的地位，從而使PCR產物仍然呈現出特異性擴增。 R.H.Don等認為，PCR過程中的前幾個循環對于擴增產物的純度非常重要，因此前幾個循環較高的退火溫度，會增加引物與模板結合的特異性，TD-PCR方法可以阻止非特異性產物的形成。由于TD-PCR的策略是在較早的循環中避免低Tm值配對，故在TD-PCR中必須采用熱啟動技術。
1.1.2.3 rpPCR
由于外源基因整合到目標基因組時常發生重排，因此Southern雜交并不能清楚地分析轉基因的拷貝數和整合情況。Kumar和Fladung在研究轉基因楊樹的外源基因整合行為時發明了rpPCR方法。這種方法就是利用不同的引物進行配對，對基因組DNA擴增，根據不同的引物對的擴增情況及產物的大小來推定 T-DNA的拷貝數、整合情況及拷貝的完整性等信息。與Southern雜交相比，該法的優點在于能比較方便快捷地指出重復單位是否完整，并能表明這種重復的方向。此方法的不足之處是在有多拷貝整合在不同的染色體上時不能顯示作用。
1.1.2.4 反向PCR
IPCR與普通PCR相同之處是都有一個已知序列的DNA片段，引物都分別與已知片段的兩末端互補。不同的是對該已知片段來說，普通PCR兩引物的3’--末端是相對的，而IPCR則是相互反向的。因而 IPCR可以擴增已知序列片段旁側的未知序列。根據這一特點，可以對外源基因在植物基因組中整合的拷貝數進行分析，多拷貝多位點整合時，擴增產物在電泳圖譜上呈現多條帶，單拷貝時只得到一條帶。
然而，該技術要求DNA模板復雜度低于109bp，如果高于此值，則不能獲得理想的效果。另外，自連接(環化)的效率也是限制該技術成功的因素。
1.1.2.5 實時定量PCR
實時定量PCR是一種在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。其特點是：特異性好，實時定量PCR技術通過引物或和探針的特異性雜交對模板進行鑒別，具有很高的準確性，假陽性低；靈敏度高，采用靈敏的熒光檢測系統對熒光信號進行實時監控；線性關系好，由于熒光信號的強弱與模板擴增產物的對數呈線性關系，通過熒光信號的檢測對樣品初始模板濃度進行定量，誤差��；操作簡單，自動化程度高，實時定量PCR技術對PCR產物的擴增和檢測在閉管的情況下一步完成，不需要開蓋，交叉污染和污染環境機會少；沒有后處理，不用雜交、電泳、拍照。
1.2 Southern雜交
Southern雜交是利用經過標記的DNA、RNA探針與靶DNA進行特異性雜交，分析外源基因在植物染色體上的整合情況(如拷貝數、插入方式)以及外源基因在轉基因后代的穩定性問題。Southern雜交可以不受操作過程中的DNA污染影響和清除轉化中的質粒殘留所引起的假陽性信號，準確度高，特異性強，是研究轉基因植株外源基因整合最可靠的方法。已廣泛應用于水稻、小麥、玉米、大豆、油菜、桃等各類作物轉基因植株的檢測。然而該方法程序復雜，成本高，且對實驗技術條件要求較高，使其使用受到了限制。
2 外源基因在轉化植株中是否轉錄的檢測與鑒定
2.1 Northern雜交
外源基因在轉化植株中的轉錄水平可以通過細胞總RNA和mRNA與探針雜交來分析，稱為Northern雜交，它是研究轉基因植株中外源基因表達及調控的重要手段。Northern雜交程序一般分為三個部分：植物細胞總RNA的提取探針的制備印跡及雜交。Northern雜交比Southern雜交更接近于目的性狀的表現，因此更有現實意義。但Northern雜交的靈敏度有限，對細胞中低豐度的mRNA檢出率較低。因此在實際工作中更多的是利用RT-PCR(reverse transcription PCR)技術對外源基因的轉錄水平進行檢測。
2.2 RT-PCR
RT-PCR的原理是在反轉錄酶作用下，以待檢植株的mRNA合成cDNA，再以cDNA為模板擴增出特異的DNA。因此，RT-PCR可在mRNA水平上檢測目的基因是否表達。RT-PCR十分靈敏，能夠檢測出低豐度的mRNA，特別是在外源基因以單拷貝方式整合時，其mRNA的檢出常用RT-PCR。
Samia Djennane等把煙草硝酸還原酶基因Nia2經農桿菌介導導入馬鈴薯，經RT-PCR分析，Nia2基因在轉基因馬鈴薯體內RNA水平得到表達。
由于RT-PCR是在總RNA或mRNA水平上操作，檢測過程中必須注意RNA的降解和DNA的污染，另外還要設置嚴格的對照來防止假性結果的出現。
3 轉基因植株外源基因表達情況的檢測與鑒定
盡管在mRNA水平也能一定程度地研究外源基因的表達，但存在mRNA在細胞質中被特異性地降解等情況，mRNA與表達蛋白質的相關性不高(相關系數低于0.5)，基因表達的中間產物mRNA水平的研究并不能取代基因最終表達產物的研究。轉基因植株外源基因表達的產物一般為蛋白，外源基因編碼蛋白在轉基因植物中能夠正常表達并表現出應有的功能才是植物基因轉化的最終目的。外源基因表達蛋白檢測主要利用免疫學原理，ELISA及Western雜交是外源基因表達蛋白檢測的經典方法。
3.1 ELISA檢測
ELISA是酶聯免疫吸附法(enzyme—linked immunosorbent assays)的簡稱，基礎是抗原或抗體的同相化及抗原或抗體的酶標記，把抗原抗體反應的高度專一性、敏感性與酶的高效催化特性有機結合，從而達到定性或定量測定的目的。ELISA有直接法、間接法和雙抗夾心法之分，目前使用最多的是雙抗夾心法，其靈敏度最高。一般ELISA為定性檢測，但若作出已知轉基因成分濃度與吸光度值的標準曲線，也可據此來確定樣品轉基因成分的含量，達到半定量測定。該方法已在棉花、辣椒、水稻、煙草、番茄等多種轉化植株的檢測中應用。
使用ELISA檢測外源基因表達蛋白具有便捷、靈敏、特異性好、試劑商業化程度高、成本低、適用范圍廣、試驗結果易讀等特點。但也存在易出現本底過高，缺乏標準化等問題。
3.2 western雜交
Western雜交是將蛋白質電泳、印跡、免疫測定融為一體的蛋白質檢測技術，其原理是將聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)分離的目的蛋白原位固定在固相膜上(如硝酸纖維膜)，再將膜放入高濃度的蛋白質溶液中溫育，以封閉非特異性位點，然后在印跡上用特定抗體(一抗)與目的蛋白(抗原)雜交，再加入能與一抗專一結合的標記二抗，最后通過二抗上的標記化合物的性質進行檢出。根據檢出結果，可知目的蛋白是否表達，濃度大小及大致的分子量。此方法特異性高，可用于定性檢測。
由于Western雜交是在翻譯水平上檢測目的基因的表達結果，能夠直接表現出目的基因的導入對植株的影響，一定程度上反映了轉基因的成敗，所以具有非常重要的意義，被廣泛采用。該方法已應用于煙草、青蒿、枸杞、楊樹等相關目的基因導入后的表達。Western雜交的缺點是操作煩瑣，費用較高，不適合做批量檢測。
4轉基因植株檢測的其它技術
4.1 基因芯片技術
生物芯片技術是起源于核酸分子雜交，于20世紀80年代提出，90年代初期迅速發展，生物芯片(biochip)是指高密度固定在固相支持介質上的生物信息分子(如寡核苷酸、基因片段、cDNA片段或多肽、蛋白質)的微陣列。生物芯片可分為基因芯片及蛋白質芯片。這兩類芯片都可用于轉基因植物的檢測與鑒定，但目前應用潛力較大的是用于轉基因植株中外源基因表達調控的cDNA芯片。cDNA芯片能夠檢測出由外源基因整合及外源基因不同的整合方式所引起的植物基因組任何微小的表達差異。將不同被測樣品的mRNA分別用不同的熒光物質標記，各種探針等量混合與同一陣列雜交，可以得到外源基因表達強度差異的信息，從而實現外源基因表達調控的比對研究。將目前通用的報告基因、選擇標記基因、目的基因、啟動子和終止子的特異片段固定于玻片上制成檢測芯片，與從待檢植株抽提、擴增、標記后DNA雜交，雜交信號經掃描儀掃描后，再經計算機軟件進行分析判斷，可對轉化植株進行有效篩選。
與常規技術相比，生物芯片技術的突出特點是高度并行性、多樣性、微型化及自動化。
目前，由于受到成本高的局限，使得該項技術的推廣應用受到了限制，同時，一些假陽性背景也使得其應用受限。相信隨著生命技術的不斷向前發展，計算機處理軟件的進一步開發利用，生物芯片必將得到越來越多的應用。
4.2 試紙條技術
與ELISA原理相似，不同之處是以硝化纖維膜代替聚苯乙烯反應板為固相載體。先將特異性抗體吸附在膜上，將膜放入混有樣品的溶液中，蛋白質隨著液相擴散，遇到抗體，發生抗原-抗體反應，通過陰性對照篩選陽性結果，并給出轉基因成份含量的大致范圍。試紙條方法是一種快速簡便的定性檢測方法，將試紙條放在待測樣品抽提物中，5-10 min就可得出檢測結果，檢測過程不需要特殊儀器和熟練技能，經濟便捷，特別適用于田間和現場檢測。但試紙條檢測只能對特定的單一靶蛋白進行檢測。
另外，近來有文獻報道了試紙條檢測技術的新發展，可利用試紙條技術對樣品中某一核酸序列進行特異性的檢測，并且實現了在同一試紙條上對多個核酸序列的同時檢測。這無疑拓展了這項技術的應用范圍，有助于檢測效率的提高。
4.3 原位雜交技術
原位雜交是通過雜交確定被檢物在樣本中的原本位置，是目前外源基因在染色體上定位及外源基因在組織細胞內表達定位的主要方法。染色體DNA原位雜交可用來確定外源基因在染色體上的整合位置，對研究外源基因遺傳特性有重要意義。許多實驗表明位置效應是影響外源基因穩定及表達的重要因素。 mRNA原位雜交可直觀地觀察到外源mRNA的表達量及不同發育時期表達有否差異。外源基因表達蛋白的組織細胞免疫定位可用來確定表達蛋白在轉基因植物組織及細胞中的分布，成為研究轉基因植物中外源基因功能及外源蛋白穩定性的重要手段。A.P.Santos等報道了利用原位雜交技術使不同組織和物種在分裂間期的外源基因(包括單拷貝基因)和它的轉錄本可視化，與在細胞分裂中期研究基因行為相比，因基因(外源基因)的表達主要是發生在染色體分裂間期的，因此更直觀、更有意義，有助于準確預測外源基因是否表達，可望減少外源基因后期檢測時間。
4.4 其它方法
近幾年還發展了一些新的外源基因的檢測方法，如質譜分析、色譜分析、生物傳感器、近紅外光譜、微纖維裝置(Microfabricated Device)等，在轉基因植物檢測中都有應用。
綜上所述，轉基因植物的檢測方法有很多。PCR可以檢測目的基因是否整合在受體細胞的染色體上，但PCR檢測靈敏，易受DNA污染，同時對多位點插入難以檢測。檢測外源基因整合在植物染色體上最可靠的方法就是Southern雜交和原位雜交。Southern雜交可檢測外源基因插入的拷貝數和插入方式，是一種較為精確的分析，也是目前鑒定外源基因存在于轉基因植物中的權威方法；原位雜交是可以檢測外源基因存在的位置、整合外源基因的染色體及外源基因在該染色體上的位置。在外源基因的轉錄水平上，可用 Northern雜交和RT-PCR檢測。Northern雜交是研究轉基因植物中外源基因表達的重要方法，然而較煩瑣，而RT-PCR較之操作簡單，且更靈敏，特別是單拷貝時更常用。外源基因若編碼蛋白，在轉基因植物中表達蛋白的檢測可采用ELISA和Western雜交。用 Western雜交檢測外源基因是否表達，用ELISA則可做定量檢測，兩者常結合起來應用。
從轉基因植物的檢測技術來看，新技術不斷涌現，多種技術相互結合，互相補充，朝著高效、便捷、安全、自動化方向發展。
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