細胞技術專題：大鼠星型膠質細胞培養實驗
大鼠星型膠質細胞培養可以：（1）用于神經系統發育、分化及再生等基礎研究；（2）腦缺血預處理上調神經保護蛋白的機制研究；（3）腦損傷和腦疼痛的研究；（4）新蛋白的功能研究。
實驗方法
- 酶消化法
- 胰酶消化法
- 胰蛋白酶消化法
| 實驗方法原理 | 大鼠星形膠質細胞原代培養后，作膠質纖維酸性蛋白(GFAP)免疫細胞化學染色鑒定，應用缺氧D-Hank液及缺氧培養罐行OGD后用臺盼藍染色及乳酸脫氫酶(LDH)漏出率檢測細胞損傷程度。 |
|---|---|
| 實驗材料 |
Wistar大鼠乳鼠 |
| 試劑、試劑盒 |
FBS DMEM 胰蛋白酶 EDTA 酒精 |
| 儀器、耗材 |
眼科剪 滴管 離心機 培養皿 CO2培養箱 |
| 實驗步驟 |
一、實驗步驟
1. 新生1-2 天Wistar大鼠乳鼠，經75%酒精消毒，斷頭處死。
2. 取腦放入冷的D-Hanks’平衡鹽溶液，去除腦膜及大血管。
3. 分離兩側大腦皮質并剪成1mm3 大小，加入0.25%胰蛋白酶37℃空氣浴震蕩消化10 min。
4. 用含10% FBS的DMEM培養基終止消化，離心(1 000 rpm，10 min)，去上清。
5. 用含10% FBS的DMEM培養基重懸沉淀，經75 µm 篩網過濾，收集濾液，再次離心10 min，收集沉淀用含10% FBS的DMEM培養基重懸，調整細胞密度至1.5×106/ml，種植于75 cm2 培養瓶。
6. 經1 小時差速黏附去除成纖維細胞后，將細胞懸液轉移到一新的75 cm2 培養瓶繼續培養，兩天換液一次。
7. 7 天后將培養瓶放入水平搖床(260 rpm，2 h，37℃)，換液棄除小膠質細胞，放入培養箱平衡1 小時，重新置于水平搖床18 h。
8. 換液棄除少突膠質細胞，用新鮮培養基洗2 遍，加入0.25%胰蛋白酶與0.02% EDTA 1:1 混合液消化、傳代備用。 二、 形態學觀察
倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態和生長狀況。 三、 細胞生長曲線繪制
傳代后的細胞以 2×104/ml 的密度種植于24 孔培養板中培養，3 天換液1 次， 每24 小時取3 孔計數，連續7 天，取均值繪制生長曲線。 四、星型膠質細胞的鑒定
膠質纖維酸性蛋白(GFAP)免疫細胞組織化學鑒定方法。取星型膠質細胞去除培養基，用PBS洗3 遍，4%多聚甲醛室溫固定1 小時，PBS洗3 次，每次5 分鐘，0.3% H2O2 30 分鐘以去除內源性過氧化物，PBS洗3 次每次5 分鐘，加含0.5% Triton X-100 的山羊血清封閉30 分鐘，滴加兔抗GFAP 抗體(1:75)，4℃ 18 小時，PBS洗3 次每次5 分鐘，滴加生物素標記羊抗兔IgG，室溫20 分鐘，PBS洗3 次，每次5 分鐘，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫20 分鐘，PBS洗3 次，每次5 分鐘，DAB顯色。 1. 形態學觀察：光鏡下，傳代的星型膠質細胞折光性強，形狀不規則，主要為多角形，胞體大而扁平、胞質豐富，細胞核圓形或卵圓形，偏于胞體一側，內有1-2 個核仁，有多個粗短枝狀初級胞突，部分細胞突起變細變長，6-7 天后細胞融合成單層，符合神經膠質細胞生長特性，如下圖。  星型膠質細胞單層生長(×100)  圖1：星型膠質細胞形成融合狀，單層生長(×200)
2. 鑒定：細胞經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)染色98%以上均為細胞漿著色，而胞核未見著色，見下圖，證明采用上述方法獲得的細胞為星型膠質細胞，純度高， 可用于實驗。
 圖2：免疫組化鑒定，GFAP 染色
3. 細胞生長曲線繪制如下：  圖3：細胞生長曲線 |
| 實驗材料 |
SD大鼠 |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 |
苯巴比妥 解剖液 胰蛋白酶 Dnase DM培養液 |
| 儀器、耗材 |
離心管 培養箱 手術器材 |
| 實驗步驟 |
一、 取14.5d SD大鼠一只。
二、 苯巴比妥0.5 ml 腹腔注射，待麻醉后置于手術臺上，酒精棉球消毒皮膚，開腹取出子宮（約12-14個），放入解剖液中，剖開子宮，取出胚胎，放入解剖液中，在耳眼之間離斷，取頭側部組織，去除腦膜組織，取原始中腦區組織，放入離心管裝的解剖液中，待全部取出后，1500轉2分鐘。 三、 用吸管吸出上清液，在組織細胞沉淀中加入胰蛋白酶一管（1 ml/vial），室溫30分鐘，1500轉，離心5分鐘（離心前可加入解剖液以終止胰酶作用）。 四、吸去上清，在組織細胞沉淀中加入Dnase 一管（2 ml/vial），37℃反應10分鐘，1500轉，離心5分鐘，吸去上清，在組織細胞沉淀中加入2 ml DM培養液吹打，計數（計數公式為（N1+N2+N3+N4）/4*10 4），以3*105個/瓶在培養瓶中培養，做好標記（時間、原代還是第幾代傳代，姓名，細胞名稱等），放入培養箱中培養。 |
| 注意事項 |
1. 麻醉藥劑量應梢大于普通用量。
展開 2. 一定要仔細剔除干凈腦膜組織，否則會極大地影響培養細胞的純度。 3. 細胞培養技術不同于分子生物學，由于離心速度較慢，離心組織和細胞貼壁不如核酸緊密，取出離心后的上清液時一定要用吸管吸取，禁止用傾倒的方法。 4. 為保護胚胎，胚胎操作應在放置冰塊的托盤中進行，保持低溫。 5. 取中腦組織時應先用兩把鑷子夾住所取區域，然后用刀片切開。 6. 胰酶在細胞離心時會對細胞產生毒性，所以胰酶離心前可加入一定的解剖液稀釋。 7. 細胞離心時最好在冰凍離心機內進行，以保持細胞活力。 8. 吹打細胞前用火燒吸管頭，發紅時逐漸后退，使吸管尖變鈍，減少吹打過程中對細胞的損害，實驗中也發現吹打時有一定的阻力。 9. 鼠胚胎較多時可分批消化，否則體外時間較長，細胞存活率低。 10. 用Neurobasal medium + B27。 11. 胰酶消化時加入EDTA可增強消化效果。 12. 關鍵在于取材的準確和原代細胞的狀態。 |
| 實驗材料 |
大鼠胚胎 |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 |
L-15培養基 膠原酶 Dnase D-MEM-BS FCS-DMEM 阿糖胞苷 |
| 儀器、耗材 |
離心機 水浴鍋 培養瓶 培養箱 |
| 實驗步驟 |
一、分離大鼠胚胎（16-18周）新皮層，置于L-15（或Hank’s平衡鹽/DMEM溶液，無Hepes）培養基中，除去腦膜和血管、海馬、尾核和其他非皮層組織。 二、 用解剖刀將其切成1 mm3大小的組織塊。 三、用1ml槍頭轉移250 μl膠原酶儲存液（1.33%，溶于L-15中）到1ml的L-15（或D-MEM）中。每2只鼠腦組織塊使用1-1.5 ml稀釋膠原酶液。 四、37℃水浴中孵育30 min。 五、1 000 rpm(大約230g)中離心5 min，或3 000 rpm(大約2 000 g)中離心1 min。 六、去上清。 七、在含EDTA-CMF的溶液中重懸細胞，并與胰蛋白酶以1：4～1：10比例混合。可以根據觀察到的細胞消化的情況，適當調整兩者的比例。 八、加入胰蛋白酶的抑制劑和DNase溶液，混合5分鐘。 九、1 000 rpm(大約230 g)中離心5 min，或3 000 rpm(大約2 000 g)中離心1 min。 十、去上清。加入500 μl D-MEM-BS。 十一、輕輕吹打成單細胞懸液，開始用5 ml槍頭吹打10次，在需要時用18-gauge的針頭吹打。( 注意：不要產生氣泡。）200目/300目尼龍網過濾。 十二、將細胞轉移到含10%FCS-DMEM的培養瓶中，培養密度為2X106/25 cm2培養瓶，4～6 X106/75 cm3培養瓶。在37.2℃，37.5%中培養。 十三、第2天換液，以后每隔3天換液。 十四、7-10天，細胞發生融合。 十五、細胞融合后，將瓶蓋用封口膜密封好，在軌跡搖床上培養，旋轉速度以不產生氣泡為宜。37℃振搖過夜。細胞注意避光。 十六、去上清，加入新鮮10%FCS-DMEM。 十七、加入200 μl 1 mM的阿糖胞苷/10 ml培養基。在37.2℃，37.5%中培養孵育48小時以消除分裂的細胞。 十八、換用新鮮10%FCS-DMEM，孵育恢復24小時。 十九、重復17-18步驟，消除所有的分裂細胞 |
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com