細胞技術專題：兔膀胱平滑肌細胞培養實驗
實驗方法
- 酶分離法
| 實驗方法原理 | 運用顯微手術器械在肉眼下仔細剔除膀胱黏膜層及漿膜層后，完整分離膀胱平滑肌層。然后以酶分離法獲取兔膀胱平滑肌細胞，體外原代和傳代培養分離細胞。在倒置顯微鏡下觀察細胞形態及生長狀況，同時進行細胞爬片H-E染色和透射電鏡等形態學觀察分析，并應用免疫熒光染色平滑肌特有的α-肌動蛋白進行細胞學鑒定分析。最后根據細胞計數繪制細胞生長曲線和增殖曲線。 |
|---|---|
| 實驗材料 |
雄性新西蘭白兔 |
| 試劑、試劑盒 |
DMEM Ⅱ型膠原酶 α-平滑肌肌動蛋白抗體 胎牛血清 胰蛋白酶 D-Hanks’液 |
| 儀器、耗材 |
飯盒 眼科直剪 眼科彎剪 眼科直鑷 眼科彎鑷 玻璃培養皿 廣口瓶 燒杯 錐形瓶 離心管 磁力攪拌器 攪拌子 目尼龍篩網 針式濾器 |
| 實驗步驟 |
一、實驗方法
1. 膀胱平滑肌細胞酶法分離 （1）肌注鹽酸氯胺酮200 mg 及氟哌利多5 mg 麻醉，待兔進入麻醉狀態后消毒，下腹正中切口，迅速切取膀胱組織。
（2）超凈臺內依次慶大霉素溶液(濃度為100 單位/毫升)、生理鹽水及D-Hanks’液中浸泡洗滌 5 分鐘，然后放入D-Hanks液中除去黏膜、黏膜下及漿膜層。
（3）肌肉剪成肉糜后0.1%Ⅱ型膠原酶(2 mg/mL) 溶液 40 過夜消化(約10-12 小時)。
（4）然后加 0.25%胰蛋白酶 370 消化30 分鐘，消化液變混濁呈絮狀提示消化良好。
（5）用100 目細胞篩過濾該絮狀液，混懸液離心(1000 轉/分，離心半徑 13 cm) 5 分鐘，沉淀的細胞移入培養皿，加入含 10%胎牛血清的DMEM，置于50 mL/L CO2、37℃飽和濕度孵育箱中靜置培養， 培養液每周更換 2-3 次。 2. 傳代培養 （1）待培養的細胞通過增殖達到約 80%匯合狀態時做傳代處理。 （2）棄去原培養瓶中的舊培養液，加入適量 的PBS(因培養液中的胎牛血清對胰蛋白酶有抑制作用)，輕輕搖動，清洗殘留的培養液后棄之。
（3）加入適量的消化液，使其覆蓋整個細胞，將培養瓶放置于CO2培養箱，不時在倒置顯微鏡下觀察，當細胞胞質回 縮，胞間間隙增大后，吸出消化液，并向培養瓶中加入含10%胎牛血清的培養液終止消化。
（4）用吸管吸取培養瓶中的培養液，反復吹打瓶壁制備細胞懸液，吹打時不能用力過猛，盡量不出現氣泡，以免損傷細胞。
（5）細胞進行計數后，按照 1X105~106細胞/mL 密度將細胞接種于培養瓶中。 3. 培養細胞的觀察及鑒定 采用倒置顯微鏡觀察平滑肌細胞的形態及生長情況。細胞爬片HE 染色觀察細胞形態，電鏡檢查，免疫組化染色檢測α-SMA。 二、結果 兩只兔所有標本均獲成功。倒置顯微鏡觀察平滑肌細胞24 小時均可見膀胱平滑肌細胞貼壁生長，正常兔 7 天左右、而梗阻兔則需10~12 天可于50 毫升培養瓶約 80%匯合。 均傳代順利，傳代后約正常兔6天左右、而梗阻兔需8~9 天可于50 毫升培養瓶約 80%匯合。 本組中均傳至第8 代，經第8 次傳代后， 平滑肌細胞仍生長迅速，未見衰老跡象。 倒置顯微鏡下觀察均呈“谷和峰”樣結構(圖1 中對照組2 周的 細胞；圖2 中實驗組培養2 周的細胞)。 細胞爬片HE染色見膀胱平滑肌細胞細胞核呈兩端鈍圓的卵圓形平滑肌細胞核型(見圖 3)。 電鏡檢查可見平滑肌細胞密班結構(圖 4)。 免疫組化染色檢測α-SMA 呈陽性反應(圖 5)。 從細胞爬片HE染色和免疫組化染色檢測α-SMA 呈陽性反應中我們發現該方法所的膀胱平滑肌細胞的純度幾乎99%。  圖1. 對照組2周的細胞
 圖2. 實驗組培養2周的細胞  圖 3. 細胞爬HE染色見膀胱平滑肌細胞 ，細胞核呈兩端鈍圓的卵圓形平滑肌細胞核型  圖4. 分離后培養細胞的電鏡檢查發現，平滑肌細胞致密斑結構
 圖5. α-SMA免疫組化證實該方法能獲得單一膀胱平滑肌細胞(棕色為α-SMA陽性) |
| 注意事項 |
1. 應嚴格無菌操作。
收起 2. 仔細徹底剝除膀胱黏膜、黏膜下及漿膜層，是確保獲的大量高質單個膀胱平滑肌細胞的基礎。 3. 膀胱平滑肌組織應盡量減碎以確保充分消化。 4. 嚴格控制膠原酶和胰蛋白酶的濃度和消化時間，見消化液混濁、組織塊呈絮狀，或在倒置顯微鏡下見消化液中有較多單個細胞或細胞小團塊時即終止消化。 5. 細胞篩的運用也是獲得高質單個膀胱平滑肌細胞的基礎。 |
| 其他 |
一、實驗討論 平滑肌細胞的培養方法可分為兩類：組織塊法和酶消化法。組織塊法適用于細嫩、易碎的組織；其方法較簡單；但容易產生雜質如成纖維細胞等，成纖維細胞生長快，故培養之細胞質量較差；培養的大多數細胞無收縮性；且原代細胞的獲得需 3-4 周，獲得大量平滑肌細胞耗時長[1]。既往酶消化法較組織塊法復雜、精細；適宜的酶濃度和培養時間的確定較為困難；然而在較短時間內可獲得大量的平滑肌細胞，1996 年Chambers等[2]報道酶消化法純度為70%。可見一種快速、高效、高純度的酶消化法培養膀胱平滑肌的方法顯得尤為重要。 本實驗研究兩只兔所有標本均獲成功。倒置顯微鏡觀察平滑肌細胞24 小時均可見膀胱平滑肌細胞貼壁生長，正常兔7 天左右、而梗阻兔則需10~12 天可于50ml 培養瓶約 80%匯合。
均傳代順利，傳代后約正常兔6 天左右、而梗阻兔需8~9 天可于50 ml 培養瓶約80%匯合。
本組中均傳至第8 代，經第8 次傳代后，平滑肌細胞仍生長迅速，未見衰老跡象。
倒置顯微鏡下觀察均呈“谷和峰”樣結構。
細胞爬片HE染色見膀胱平滑肌細胞細胞核呈兩端鈍圓的卵圓形平滑肌細胞核型。
電鏡檢查可見平滑肌細胞密班結構。免疫組化染色檢測α-SMA呈陽性反應。
從細胞爬片HE染色和免疫組化染色檢測α-SMA呈陽性反應中我們發現該方法所的膀胱平滑肌細胞的純度幾乎 99%(在以下的膀胱平滑肌細胞的共聚焦檢測中也證實了這一點)。
膀胱平滑肌的鑒定[3]主要根據其細胞形態及α-actin的檢測。
倒置顯微鏡下觀察均呈“谷 和峰”樣結構；細胞爬片HE染色見膀胱平滑肌細胞細胞核呈兩端鈍圓的卵圓形平滑肌細胞核型；電鏡檢查可見平滑肌細胞密班結構，這些細胞形態學的檢測均證實其為膀胱平滑肌細胞。
免疫組化染色檢測α-SMA呈陽性反應更進一步證實了該方法所獲得的細胞為膀胱平滑肌細胞。
梗阻后的膀胱平滑肌細胞在生長擴增中明顯較正常膀胱平滑肌細胞 時間長，說明了這種酶消化法對膀胱平滑肌細胞的影響不是太大，還是保留著體內的基本特性。
在我們的激光掃描共聚焦顯微鏡的檢測中平滑肌細胞內的鈣離子熒光強度在M受體激動劑的影響下發生明顯變化，這更進一步證實了該方法分離培養出的膀胱平滑肌仍保持著收縮功能。 二、參考文獻 1. Korkmaz M, Guvenc BH, Bilir A et al. Isolation and culture of adult and fetal rabbit bladder smooth muscle cells and their interaction with biopolymers. J Pediatr Surg, 2003,38(1):21-24.
2. Chambers P,Neal DE,Gillespie JI. Ca2+ signalling in cultured smooth muscle cells from human bladder.Exp Physiol,1996,81(4):553-564. 3. ChamLey CJ,Campbell GR,Ross R.The smooth muscle cells in culture. Physiol Rev,1979,599(1):1-61. 4. Sui GP, Wu C, Fry CH .A description of Ca2+ channels in human detrusor smooth muscle. BJU Int,2003,92(4):476-478. 5. Sui GP, Wu C, Fry CH. The electrophysiological properties of cultured and freshly isolated detrusor smooth muscle cells. J Urol, 2001,165(2):627-632. |
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