Northern blot實(shí)驗(yàn)方法
實(shí)驗(yàn)方法
- Northern blot技術(shù)
- Northern Blot
| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | Northern blot的基本概述是將RNA樣品通過(guò)變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，再轉(zhuǎn)移至尼龍膜等固相膜載體上，用放射性或非放射性標(biāo)記DNA或RNA特異性探針對(duì)固定于固相膜上的mRNA進(jìn)行雜交，洗膜去除非特異性結(jié)合雜交信號(hào)，經(jīng)放射自顯影或現(xiàn)色反應(yīng)，對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行分析。將雜交的mRNA分子在電泳中遷移位置與標(biāo)準(zhǔn)分子量分子進(jìn)行比較，即可知道細(xì)胞中特定的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的大小；對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱比較，可以知曉該基因表達(dá)mRNA水平的強(qiáng)弱。 |
|---|---|
| 實(shí)驗(yàn)材料 |
DNA |
| 試劑、試劑盒 |
MOPS電泳buffer 甲醛凝膠加樣buffer EB EGFR探針 DIG SSC |
| 儀器、耗材 |
水平電泳儀 制冰機(jī) 恒溫水浴箱 凝膠成像系統(tǒng) EP管 移液器 Tip頭 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 |
一、RNA轉(zhuǎn)移與固定
1. 變性瓊脂糖電泳分離總RNA樣品完成后，1×MOPS buffer淋洗凝膠片刻，10×SSC中浸泡平衡凝膠30 min。 2. 按southern blot實(shí)驗(yàn)中DNA轉(zhuǎn)移方法及裝置轉(zhuǎn)移總RNA至尼龍膜上（過(guò)程中注意無(wú)RNA酶操作）。 3. 1×SSC淋洗尼龍膜后濾紙吸干，夾在2層干凈濾紙中80℃烤箱烘烤2小時(shí)。
4. RNA染色，干燥的尼龍膜先于5%冰乙酸中室溫浸泡15 min。
5. 于0.5 mol/L 乙酸鈉和0.04%亞甲藍(lán)溶液中浸泡5~10 min。 6. 去離子水淋洗膜5~10 min，可見(jiàn)RNA標(biāo)準(zhǔn)及28s及18 sRNA的條帶，軟鉛筆標(biāo)記。 二、預(yù)雜交、雜交及顯色
1. Washing buffer潤(rùn)洗1遍（3~5 min）。 2. 100 ml blocking buffer工作液封閉30 min。
3. 100 ml antibody buffer（1：5000）孵育30 min。
4. Washing buffer洗膜（15 min×2）。
5. 20 ml detection buffer 平衡2~5 min。
6. 將尼龍膜置于10 ml color-substrate solution 棕色瓶中，避光數(shù)min至1天（出現(xiàn)顏色時(shí)不要搖動(dòng)）。
7. 當(dāng)出現(xiàn)條帶時(shí)，TE-buffer洗膜（5 min×1），終止現(xiàn)色。 8. 照相記錄，80℃烤干，儲(chǔ)存。
9. 掃描計(jì)算EGFR基因擴(kuò)增的倍數(shù)。 |
| 注意事項(xiàng) |
1. 避免RNA酶污染，防止RNA降解。
2. 凝膠中最好不要加入EB，以免降低雜交的效率。 3. 為降低膜雜交本底，可適當(dāng)延長(zhǎng)預(yù)雜交時(shí)間。 |
標(biāo)簽：
RNA
northern blot
- PCL-PVAc-PEG在活性物遞送和生物材料上的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)
- PROTAC連接子中作用機(jī)制及氮雜環(huán)的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)與功能特性
- OK432在腫瘤和免疫研究中的作用機(jī)制及應(yīng)用優(yōu)勢(shì)
- 鐵調(diào)素Hepcidin-25作為鐵代謝和免疫反應(yīng)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的功能和作用
- 糖蛋白Fibronectin在細(xì)胞培養(yǎng)中的功能及作用
- TDP-43的結(jié)構(gòu)與功能及在漸凍癥(ALS)等神經(jīng)退行性疾病中的作用機(jī)制
- DNP-BSA(2,4-二硝基苯偶聯(lián)牛血清白蛋白)在免疫學(xué)研究與檢測(cè)中的作用
- AbMole LPS（脂多糖）在免疫激活、動(dòng)物造模等方面的應(yīng)用及案例分享
- MCE中國(guó)將攜試劑產(chǎn)品亮相美國(guó)芝加哥2025 AACR年會(huì)
- 2024年"MCE中國(guó)生命科學(xué)研究促進(jìn)獎(jiǎng)"評(píng)獎(jiǎng)結(jié)果公布
- 陶術(shù)生物直播預(yù)告：受體藥理學(xué)與藥物發(fā)現(xiàn)研究
- 安捷倫免疫組化法PD-L1檢測(cè)試劑盒獲得歐盟IVDR認(rèn)證
- 德國(guó)Massive Photonics推出多款DNA-PAINT各系試劑盒
- 天隆自主研發(fā)HCV核酸檢測(cè)試劑盒獲批藥監(jiān)局三類(lèi)NMPA
- 蘭博利德推出新品高保真快速擴(kuò)增 PCR mix試劑盒
- IPHASE邀您共赴BIOCHINA2025第十屆易貿(mào)生物產(chǎn)業(yè)大會(huì)
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網(wǎng) 電話(huà)：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com