通過生化和遺傳學研究表明，RNA干擾包括起始階段和效應階段(inititation and effector steps)。在起始階段，加入的小分子RNA被切割為21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。證據表明；一個稱為Dicer的酶，是RNase III家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導入或者由轉基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個片段的3’端都有2個堿基突出。

 

在RNAi效應階段，siRNA雙鏈結合一個核酶復合物從而形成所謂RNA誘導沉默復合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一個ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的過程。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉錄本上，并在距離siRNA3’端12個堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機制尚不明了，但每個RISC都包含一個siRNA和一個不同于Dicer的RNA酶。

 

另外，還有研究證明含有啟動子區的dsRNA在植物體內同樣被切割成21-23nt長的片段,這種dsRNA可使內源相應的DNA序列甲基化,從而使啟動子失去功能,使其下游基因沉默.

 

(一)siRNA的設計

 

1. 在設計RNAi實驗時，可以先在以下網站進行目標序列的篩選：

http://www./business/products/order2.htm

http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html

http://www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html

http://design.dharmacon.com/rnadesign/default.aspx?SID=45358710

 

2.RNAi目標序列的選取原則：

(1)從轉錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3'端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結果顯示GC含量在45%―55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。

Tuschl等建議在設計siRNA時不要針對5'和3'端的非編碼區（untranslated regions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調控蛋白結合區域，而這些UTR結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP核酸內切酶復合物結合mRNA從而影響siRNA的效果。

(2)將潛在的序列和相應的基因組數據庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。

例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）

(3)選出合適的目標序列進行合成。通常一個基因需要設計多個靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。

 

3.陰性對照

一個完整的siRNA實驗應該有陰性對照，作為陰性對照的siRNA應該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結果以保證它和目的靶細胞中其他基因沒有同源性。

 

4.目前已證實的siRNA可以在下面的網頁找到：

http://design.dharmacon.com/catalog/category.aspx?key=49

http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_502.html

http://web.mit.edu/mmcmanus/www/siRNADB.html

http://python.penguindreams.net/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Published

目前為止較為常用的方法有通過化學合成，體外轉錄，長片斷dsRNAs經RNase III 類降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)體外制備siRNA，以及通過siRNA表達載體或者病毒載體，PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達產生siRNA。

 

1． 化學合成生產siRNA

優點：方便，研究人員幾乎不需要做什么工作。

缺點：價格較貴，效率只有轉錄合成的shRNA的1/10-1/40，基因抑制持續時間短，對細胞毒性大，轉染效率低，此外由于合成工藝上存在不可彌補的缺陷，此方法不能合成shRNA，不能糾正合成中產生的20%左右的堿基錯誤。

適用于：建議不再采用此種合成方法。

不適用于：基本上對目前所有的實驗室來說均不適用。

評價：☆☆☆☆☆

 

2． 生物合成轉錄生產編碼siRNA

優點：價格較低，抑制效率高，低濃度的siRNA即可達到抑制效果。體外轉錄合成，比較接近生理狀態。

缺點：無法保證有效性，實驗規模受到限制，不能進行大量的生產，不能維持長時間抑制效應，而且需要用戶參與操作，難以保證實驗的一次成功性。

適用于：篩選siRNAs特別是需要制備多種siRNAs，考慮合成價格時。

不適用于：實驗需要大量的一個特定的siRNA。長期研究。

評價：★★★☆☆

 

盡管有些公司推出了shRNA和siRNA試劑盒，但這些試劑盒大都突出操作簡單，畢竟涉及RNA操作，用戶自己難免會產生很多預料不到的困難，晶賽公司可以完全為您解決后顧之憂，您可以直接拿到有效的siRNA或shRNA序列。

 

3． Dicer酶法生產siRNA

優點：可以跳過篩選與檢測有效siRNA序列的步驟，節省時間和開支。

缺點：有可能引發非特異性的基因沉默，尤其是同源或者密切相關的基因。

適用于：快速而經濟地研究某個基因功能缺失的表型

不適用于：長期研究項目，或者是需要一個特定的siRNA進行研究

評價：★★★☆☆

 

4．編碼shRNA的載體生產siRNA

優點：制備質量可控性好，帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持續抑制靶基因的表達，持續數星期甚至更久，可以大量擴增。

缺點：轉錄后的shRNA的正確折疊率不能保證，有可能因此造成非特異性抑制，質粒載體轉染效率不穩定，與細胞類型有關。

適用于：已知一個有效的siRNA序列，需要維持較長時間的基因沉默，或者需要用抗生素篩選能表達siRNA的細胞。長期研究。

不適用于：篩選siRNA序列（其實主要是指需要多個克隆和測序等較為費時、繁瑣的工作

評價：★★★★☆

 

晶賽公司擁有一項編碼shRNA的載體生產siRNA的專利技術，最多可以一次編碼6個目標基因的siRNA序列，為您節省了篩選時間，保證了siRNA的有效性。具體詳情：http://www./html/products.htm#6

5．病毒粒子生產shRNA

優點：易于制備、純化、濃縮,宿主范圍廣,感染率高,理化性質穩定,不整合宿主基因組,遺傳毒性和免疫毒性低，是目前最好的RNA干擾技術之一。

缺點：耗費時間比較長，即使是用最快的也得60天左右，對實驗條件要求較高，容量偏小，有可能伴隨部分炎癥反應。

適用于：轉染效率低無法解決，需要維持較短時間的基因沉默的siRNA

不適用于：大量篩選siRNA或長時間的研究，主要原因是價格因素

評價：★★★★★

 

晶賽公司擁有一項未公布的病毒制備技術，可以在15天內完成shRNA病毒制備，價格接近shRNA制備的其他方法，將極有可能取代常規病毒表達shRNA的方法成為最佳的RNA干擾技術。

 

6．PCR制備shRNA表達框生產siRNA

優點：成本較低，方便快捷，可以用于有效序列的篩選，可以用于質粒載體構建。

缺點：轉染效率低，不適合大規模制備。

適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動子

不適用于：長期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了）

評價：★★★☆☆

 

1． 確立需要干擾的目標基因

2． 檢查使用細胞的轉染情況

可以選擇一個4kb左右大小的質粒和可實施的轉染方法，檢測轉染效率

轉染效率超過40%：可以選擇任何一種RNA干擾方法。

轉染效率介于10%-40%：可以選用體外合成的si RNA或者帶有篩選標記的shRNA質粒表達載體。

轉染效率低于10%：帶有篩選標記的shRNA質粒表達載體或病毒載體。

3． si RNA序列選擇設計

制備20-30個si RNA序列，選擇有效序列或委托專業化公司（如：晶賽生物）設計（3個序列保證1個有效）

4． 開始實驗

1. 研究基因功能的新工具

已有研究表明RNAi能夠在哺乳動物中滅活或降低特異性基因的表達，制作多種表型，而且抑制基因表達的時間可以隨意控制在發育的任何階段，產生類似基因敲除的效應。線蟲和果蠅的全部基因組序列已測試完畢，發現大量未知功能的新基因，RNAi將大大促進對這些新基因功能的研究。與傳統的基因敲除技術相比，這一技術具有投入少，周期短，操作簡單等優勢，近來RNAi成功用于構建轉基因動物模型的報道日益增多，標志著RNAi將成為研究基因功能不可或缺的工具。

 

2. 研究信號傳導通路的新途徑

聯合利用傳統的缺失突變技術和RNAi技術可以很容易地確定復雜的信號傳導途徑中不同基因的上下游關系，Clemensy等應用RNAi研究了果蠅細胞系中胰島素信息傳導途徑,取得了與已知胰島素信息傳導通路完全一致的結果,在此基礎上分析了DSH3PX1與DACK之間的關系, 證實了DACK是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶. RNAi技術較傳統的轉染實驗簡單、快速、重復性好，克服了轉

 

染實驗中重組蛋白特異性聚集和轉染效率不高的缺點， 因此認為RNAi技術將可能成為研究細胞信號傳導通路的新途徑。

 

3.開展基因治療的新策略

RNAi具有抵抗病毒入侵，抑制轉座子活動，防止自私基因序列過量增殖等作用，因此可以利用RNAi現象產生抗病毒的植物和動物，并可利用不同病毒轉錄序列中高度同源區段相應的dsRNA抵抗多種病毒。

 

腫瘤是多個基因相互作用的基因網絡調控的結果，傳統技術誘發的單一癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉腫瘤的生長, 而RNAi可以利用同一基因家族的多個基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性, 設計針對這一區段序列的dsRNA分子，只注射一種dsRNA即可以產生多個基因同時剔除的表現，也可以同時注射多種dsRNA而將多個序列不相關的基因同時剔除。

 

盡管目前RNAi技術在哺乳動物中的應用還處于探索階段，但它在斑馬魚和老鼠等脊椎動物中的成功應用預示著RNAi將成為基因治療中重要的組成部分，人工合成的dsRNA寡聚藥物的開發將可能成為極具發展前途的新興產業。