論文摘自山東師范大學化學化工與材料科學學院，濟南 250014

摘 要 熒光顯微鏡與熒光光譜儀耦合系統可獲取顯微熒光成像及微區熒光光譜、熒光壽命的測定信息，廣泛應用于細胞、組織中蛋白質的結構功能分析，核酸的識別檢測，金屬離子、自由基的定量測定，以及納米生物探針的研制等生物分析研究的熱點領域。

1 引 言
熒光顯微鏡在生物學和醫學領域已得到了廣泛應用，是觀測細胞形態、結構和生命現象的有力工具。熒光顯微鏡作為一種必不可少的分析手段，常用于定性觀察細胞內部熒光物質的空間分布和強度分布，得到細胞的熒光圖像，研究細胞的結構。然而熒光顯微鏡不能定量給出圖像發光的強度數值，無法研究細胞圖像發光強度變化不大或熒光物質空間分布變化細微的生理過程。因此，隨著生物醫學的飛速發展，迫切需要有更高靈敏度，操作更快捷，功能更加完備的儀器來滿足生物學和醫學研究發展的要求。熒光顯微鏡與熒光光譜儀耦合而成的系統儀器能夠獲取顯微熒光成像及微區熒光強度、熒光壽命的測定信息。選擇熒光探針對被標記物進行特異性標記，熒光探針的亮度即熒光強度可反映被標記物相對含量的多少。熒光顯微鏡對圖像采集后，熒光光譜儀可測量圖像的熒光強度，對獲取的圖像進行熒光強度的定量，為全面分析和研究細胞內部結構提供更加詳盡的數據信息。

2 熒光顯微鏡與熒光光譜儀耦合系統及特點
應用單臂光纖連接熒光顯微鏡與熒光光譜儀，實現熒光光譜測量和細胞實時成像二維信號的同時采集。以高頻脈沖激光器作為激發光源激發顯微鏡下樣品，使之發射出可見范圍內的波長，呈現熒光映像。用熒光顯微鏡的物鏡收集信號，通過單臂光纖將耦合好的熒光信號從熒光顯微鏡傳導至熒光光譜儀，記錄熒光發射光譜。電感耦合相機（charged coupled device，CCD）攝像系統作為光電傳感器用于顯微鏡圖像獲取技術采集細胞圖像，并將圖像信號轉換成電信號輸入計算機進行數據讀取及圖像處理，獲取微區熒光光譜掃描譜圖的詳細信息，并對圖像進行采集、曝光調整、多色彩空間的影像編輯、預定義的影像設置、自動調焦、自動后處理加工調整，獲得色彩鮮艷、清晰度高的影像。應用光纖耦合熒光光譜儀與熒光顯微鏡，配合熒光圖像掃描顯微熒光光譜及進行微區熒光壽命的測定（超高時間分辨率，可得到復合物中不同組分的熒光壽命），優化升級了作為單一儀器的功能。紅敏光電倍增管（PMT）和紅外PMT 切換使用滿足超寬光譜范圍探測（200 ～1700 nm），適合從紫外到近紅外波段熒光光譜的特性研究，為生物體系中近紅外熒光探針的開發應用研究提供了有力的支持。

3 生物分析中的應用
熒光探針是設計用來進行生物標本特定區域內定位或對特定刺激反應的熒光團，可以高度敏感性和選擇性的檢測復雜生物分子及活細胞中的特定成分。相對于常規熒光檢測而言，在近紅外光區，生物基體光吸收或熒光強度很小，且致密介質（如組織）的光散射明顯降低，激發光的穿透性更強，因而自發熒光的背景干擾顯著降低。熒光探針由于其特殊的光物理和光化學特性而具有靈敏度高、動態響應范圍寬的優點，且其測定條件適宜生命體的生理環境而被廣泛地應用于生命科學研究領域。設計近紅外熒光探針引入組織和細胞，富集在組織和細胞的特定成分中，在熒光顯微鏡下不僅可觀察固定的細胞、組織切片，還可對活細胞的結構、生物大分子等進行實時觀察和檢測，配合熒光光譜儀獲取熒光圖像的量化信息。因此，熒光顯微鏡與熒光光譜儀耦合系統在生物分析領域中將具有廣泛的應用前景。

蛋白質結構和功能分析及核酸的識別檢測

生物體內細胞的生理狀態受內部和外部因素的影響，可通過基因表達和后續的蛋白質表達表現出來。因此，蛋白質的結構與功能研究是認識生命過程的關鍵�；罴毎麅鹊鞍踪|的顯微熒光成像分析是生物顯微技術的一個重要方面。Dawn 等成功設計合成了活細胞中定點標記N 端為半胱氨酸蛋白質的一系列熒光分子探針。這種熒光分子探針利用生理條件下含硫代酸酯的小分子可有效穿過細胞膜與 N 端為半胱氨酸的蛋白質進行化學選擇性反應產生熒光，跟蹤檢測蛋白質的功能及相互作用。利用熒光顯微鏡觀察了探針標記細胞的顯微熒光成像，根據熒光光譜確定探針的發射波長處于近紅外波段，適用于活細胞中蛋白質的熒光成像分析檢測。

生命活動離不開酶的催化作用，機體內的物質代謝在酶的催化下有條不紊地進行。酶是由活細胞合成的，是能夠對特異底物起高效催化作用的蛋白質。基于熒光的酶分析方法隨著酶熒光探針的開發得以廣泛應用，熒光顯微鏡常用于檢測熒光酶細胞化學的作用。為了研究某些細胞內的生理過程，經常將熒光共振能量轉移（FRET）與熒光顯微技術結合起來。Mupam 等就通過熒光顯微鏡、CCD 和熒光光譜儀來進行完整細胞中 FRET 發生的定位，將細胞內的理化反應研究提高到細胞器的水平。Chi-wang等利用 FRET 工作原理設計的熒光探針包括一個對已知蛋白激酶特異性識別的底物結構域，一個與磷酸化絲氨酸底物結構相結合的磷酸化識別結構域。當底物結構被磷酸化后，分子內部就會發生磷酸化識別結構域與其結合而引起的內部折疊，探針兩端兩個熒光蛋白相互靠近就會發生能量轉移。熒光光譜提供分子發生磷酸化前后的熒光強度變化，熒光顯微鏡獲得 FRET 成像反映供體蛋白與受體蛋白之間的相互作用，做到活細胞內定時、定量、定位地觀測蛋白激酶活性變化。

核酸是生命的信息物質，對蛋白質的合成、細胞分裂和復制以及生物遺傳起著重要作用。熒光探針技術具備方法簡便，靈敏度高等優點，結合熒光顯微鏡應用于核酸的定量分析、結構及作用機理的研究日益廣泛。分子信標作為敏感、特異的核酸探針，通過空間結構改變決定發射熒光特性，實現活細胞中核酸的定位信息采集及定量檢測，利用分子信標技術可以對生物大分子在活體內的代謝等動態過程進行跟蹤分析。Santangelo 等設計了一對與待測目標 mRNA 序列互補的新型分子信標，制成脂質體使之攝入細胞，與目標 mRNA 雜化時產生 FRET，較之單一分子信標有效抑制了主動錯誤信息的檢出，靈敏定量檢測目標 mRNA。應用顯微注射法注入活體細胞獲取熒光顯微成像，檢測熒光強度實時反映活體 RNA 的代謝轉移過程。(更多信息請訪問精譜徠官網）