前言簡介
α–klotho是經(jīng)基因改造(類似患有人衰老癥狀)小鼠體內(nèi)的一種負調(diào)節(jié)基因，其基因序列存在多個種屬，包括基于小鼠研究的人類，α–klotho蛋白是一種分子量約為130kDa的橫跨膜蛋白，在腎臟和甲狀旁腺內(nèi)表達.
近年來，已證實α–klotho是機體調(diào)節(jié)礦物質(zhì)代謝的重要因子，如鈣和磷的代謝.因此認為,小鼠幼齡老化癥狀就是因為α–klotho的缺失導(dǎo)致礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)破壞而引起的. 同時，據(jù)報道,構(gòu)成α–klotho蛋白序列主要部分的長N-端胞外域可經(jīng)分離釋放至血液.然而對于可溶性α–klotho蛋白發(fā)揮的功能和變化仍存很多疑點，所以急需研制一套α–klotho檢測系統(tǒng)
此ELISA試劑盒可用于檢測人血液的α–klotho蛋白

實驗原理
此固相ELISA試劑盒基于夾心法原理，利用兩種不同的高特異性抗體，TMB作為底物顯示劑，顯色強度與人可溶性α–klotho的量成正比

檢測范圍
93.75~6000pg/mL

預(yù)期用途
此試劑盒可用于血清，血漿和尿液中人可溶性α–klotho的定量檢測

試劑盒組成

1、   包被板: 包被有抗人可溶性α–klotho（67G3）小鼠IgG單抗，親和純化      96T x 1

2、   濃縮標記抗體: (30X) HRP標記的抗人可溶性α–klotho小鼠IgG Fab’親和純化              0.4ml x1

3、   標準品: 重組人可溶性α–klotho                                         0.5mlx2

4、   EIA緩沖液:                                                           30mlx1

5、   標記抗體稀釋液: 1%BSA，含0.05%吐溫20的PBS                          12mlx1

6、   顯色劑:TMB底物液                                                    15mlx1

7、   終止液: 1N硫酸                                                       12mlx1

8、   濃縮洗滌緩沖液: (40X)含0.05%吐溫20的磷酸緩沖液                       50mlx1

實驗所需材料( 但試劑盒未提供)
酶標儀（450nm）      微量移液管和加樣槍頭
量筒和燒杯            去離子水
吸水紙                坐標紙
標準品稀釋管           洗瓶
一次性試管

試劑準備

1、   洗滌緩沖液的準備：

先將(40X)洗滌濃縮液平衡至室溫，充分混勻，取50ml濃縮液與1950ml的去離子水混勻，即得. 稀釋洗滌液應(yīng)保存于冰箱內(nèi)，2周內(nèi)用完

2、   酶標記抗體的準備：

用標記抗體稀釋液將標記抗體稀釋至30倍，即得
例：如果只測一條板，8孔，則需要標記抗體800ul（30ul的標記抗體+870ul的標記抗體稀釋液，混勻，使用時每孔各加100ul）
此步驟應(yīng)在標記抗體使用前完成
剩余的標記抗體濃縮應(yīng)裝于密封瓶內(nèi)，于4℃保存

3、   標準品的準備：

吸取0.5ml的去離子水至標準品瓶內(nèi)，充分混勻，得到12000pg/ml的人可溶性α–klotho標準品

4、   標準品的稀釋：

準備8個試管用于標準品的稀釋，各加230ul的EIA緩沖液, 配制成以下8管濃度
1號管                 6000pg/ml
2號管                 3000pg/ml
3號管                 1500pg/ml
4號管                 750pg/ml
5號管                 375pg/ml
6號管                 187.5pg/ml
7號管                 93.75pg/ml
8號管                 0pg/ml（試驗樣品空白）
吸取230ul的標準品于1號管混勻，然后從1號管吸取230ul加入2號管混勻，如下圖所示,按此規(guī)律稀釋，標準品范圍為6000~93.75pg/ml. 8號管作為樣品空白,濃度為0pg/ml.

5、   樣品稀釋：

根據(jù)要求,用EIA緩沖液稀釋樣品.血清,血漿或尿液樣品建議稀釋2~4倍

實驗步驟
使用前，將所有試劑應(yīng)平衡至室溫，大約30min，充分混勻，確保試劑質(zhì)量無變化，標準曲線和樣品檢測同時進行.

試劑	檢測樣品	標準品	樣品空白	試劑空白
	檢測樣品100ul	稀釋標準品（1-7管）100ul	EIA緩沖液（第8管）100ul	EIA緩沖液100ul
蓋板，于室溫下溫育60min
洗板7次
酶標抗體	100ul	100ul	100ul	-
蓋板，于室溫下溫育30min
洗板9次
顯色劑	100ul	100ul	100ul	100ul
室溫避光溫育30min
終止液	100ul	100ul	100ul	100ul
加終止液,30min內(nèi)于450nm處讀取OD值

 

特別注意

1、   試驗樣品采集后應(yīng)立即檢測或凍存,避免反復(fù)凍融樣品,檢測前應(yīng)在低溫下先將其完全溶解混勻尤其是尿液樣品，溫度和凍融對其比血漿或血清穩(wěn)定性影響更大,所以樣品采集后應(yīng)立即凍存，避免重覆凍存

2、   試驗樣品根據(jù)所需,用EIA緩沖液稀釋

3、   建議各試驗樣品和標準品做雙份檢測

4、   試驗樣品應(yīng)在中性PH范圍，有機溶劑的污染可能會影響實驗結(jié)果

5、   只能用本試劑盒提供的洗滌液洗板，不充足的洗滌會導(dǎo)致試驗失敗

6、   用吸水紙拍干微孔板，避免刮擦

7、   TMB底物液應(yīng)貯存于黑暗處，因其對光敏感，且避免接觸金屬

8、   加入終止液后,30min內(nèi)必須讀數(shù)

結(jié)果計算
繪制標準曲線前，所有的數(shù)據(jù)(包括標準品和未知的樣品)都應(yīng)減去試驗樣品空白值.以標準品的濃度及相對應(yīng)OD值，在坐標紙上繪制標準曲線,從標準曲線上可直接讀取未知樣品的濃度
 

此標準曲線僅供示例演示,不能用于獲取試驗數(shù)據(jù).每次檢測都應(yīng)建立其標準曲線.
 
 
本譯文僅供參考，詳情請以原文為準。