數字PCR，LunaProbes^TM和MAAB相結合可以檢測到低于0.01%的等位基因的突變
Matt Poulson, Jason McKinney
Idaho Technology, Inc. Salt Lake City, Utah, USA

引言

    低水平突變的檢測促使了許多新方法的發展。我們結合現有的三個技術：數字PCR，非標記探針法和MAAB（突變等位基因的偏向性擴增）（見圖1）。數字PCR（Vogelstein and Kinzler，1999）需要許多重復的樣本使模板稀釋至約1拷貝/反應。將原始的數字PCR進行一些改進后可以進行高分辨溶解曲線分析（HRM），要求模板稀釋為5個拷貝/反應 (McKinney, 2007)。這表明，如果存在突變的等位基因，一個反應中至少包括20%的等位基因并且可以檢測到異源雙鏈的存在。通常數字PCR檢測的靈敏度約為2%。并且靈敏度是可以增加的，這主要取決于重復檢測的數量。非標記探針法在PCR反應中加入3’端封閉的非標記寡核苷酸（Zhou，2005）。在使用HRM儀器時除了進行掃描之外，非標記探針增加了基因分型的功能（見圖2）。非標記探針的靈敏度大約在5%（Wall，2007）。MAAB利用非標記探針增加了穩定性，探針與野生型等位基因完全匹配，和突變的等位基因不完全匹配，使突變的等位基因得到優勢擴增。MAAB的靈敏度可以低于1%（McKinney，2009）。本實驗中，我們結合這三種方法來增加HRM的靈敏性和有效性。

材料和方法

    苯丙氨酸羥化酶基因11外顯子（PAH×11）存在一個SNP，使用標準的非標記探針法進行檢測。兩個等位基因純合子樣品進行了鑒定。野生型和純合突變樣本的標準化濃度為15ng，然后混合進行一系列稀釋，突變的等位基因可以到0.01%。1%、0.1%和0.01%的等位基因樣本然后連續稀釋到5-100拷貝。之后，1%、0.1%和0.01%突變的等位基因使用96孔板分別采用數字PCR，數字PCR+非標記探針以及數字PCR+非標記探針+MAAB的方法進行實驗。每個實驗包括兩個重復，100%野生型和100%突變樣品每個反應15ng以及兩個不加模板的對照。MAAB和數字PCR+非標記探針+MAAB的方法使用Eppendorf Realplex4 Master Cycler Pro S (Eppendorf, Westbury, New York)，退火溫度為57℃，可以達到MAAB的條件。Eppendorf儀器的溫度轉換率可以達到6℃/s。快速的升溫速率對于完成MAAB實驗的PCR是至關重要的。在PCR退火時快速的升溫速率探針和目的區域緊密結合從而有效的阻礙了野生型等位基因引物的延伸。快速的升溫速率也可以減少野生型等位基因的擴增，探針和野生型等位基因鏈解鏈之后，在變性過程中減少了擴增WT等位基因的酶的時間。數字PCR和數字PCR+非標記探針在Bio-Rad IQ thermal cycler (Bio-Rad, Hercules, CA)上運行。退火溫度為68℃，在72℃延伸，以去除任何等位基因的偏差。樣品擴增完用LightScanner96進行溶解分析（Idaho Technology Inc., Salt Lake City)（見圖2）。

結果和討論

    數字PCR每個反應使用的模板量為5ng（大約1.5copies）。數字PCR僅能對擴增峰進行分析。數字PCR在這一稀釋濃度時可以成功擴增，并且可以檢測到雜合樣本中0.1%的突變。在其他等位基因的實驗中，數字PCR不能夠檢測出樣品中任何的突變的等位基因。加上非標記探針法之后不僅可以提高數字PCR的靈敏度，而且可以檢測到每一個突變等位基因混合后的突變。數字PCR加非標記探針和MAAB的方法使突變的等位基因的檢測能力增加了，42個樣本檢測到1%的突變混合，37個樣本檢測到0.1%，43個樣本檢測到0.01%（見圖3）。盡管使用非標記探針和MAAB的數字PCR是技術上非數字化的模板拷貝數，但是仍要小于常規PCR的模板量。MAAB在高WT等位基因的背景下能夠增加檢測突變等位基因的能力。加上非標記探針的數字PCR和MAAB技術使用的模板濃度達到300pg（100copies/reaction）時突變的檢測率仍舊能夠達到0.01%（見圖4）。

結論

    檢測低水平的DNA突變有許多用途。其中包括檢測致病菌耐藥性、非侵入性產前篩查，低水平體細胞突變以及檢測外周血治療后的一些其他疾病。結合使用數字PCR，非標記探針和MAAB后靈敏度可以增加10-100倍，而且可以通過具體的探針峰來確定突變的等位基因，可以減少測序的費用。