目標

ACQUITY UPLC ® H- Class 系統采用四元溶劑混合的自動化優化方案，對肽譜分析條件進行系統性優化。

背景

肽譜分析用于確認某種蛋白質的一級結構，識別翻譯后修飾（PTM），并分析雜質。任何蛋白質結構差異反映在含有該修飾的肽保留時間的變化中。

某種蛋白質的完整結構定性，需要能夠分辨 100 或者 100 個以上的多肽分辨率，這些多肽的分子大小和分子特性跨度范圍很大。當開發分離這些肽段的分離條件時，包括改變流動相組成和有機溶劑組成的變化。而且每項測定條件要求制備一對混合溶劑，該溶劑涉及兩項或者三項準確的量度。

采用 ACQUITY UPLC H- Class 系統進行四元溶劑的混合，混合溶劑的產生是由系統從純溶劑瓶中抽出混合而成。此方式減少了制備許多溶劑混合物的工作量，而且使得出錯的可能性最小化。同時能夠簡易地測定中間組分。

ACQUITY UPLC H- Class 系統簡化了可用于定性蛋白質的結構的肽圖譜分析方法的開發和優化。

ACQUITY UPLC H-Class 系統以及它的四元溶劑混合能力旨在幫助客戶關注分析的質量 , 高效地獲取可靠的結果。

溶液

采用 ACQUITY UPLC BEH 300 C 18 色譜柱和多重流動相溶劑分離 MassPREP TM 烯醇酶的胰蛋白酶酶解肽段標準品。在 ACQUITY UPLC H-Class 系統中，我們設置水為 A 路溶劑，乙腈為 B 路溶劑，異丙醇為 C 路溶劑， 1% 的 TFA 水溶液作為 D 路溶劑。為了評估酸濃度的效果，三種相同梯度的乙腈升高洗脫梯度分別在 2.5% ， 5% 和 10% 的 D 條件下運行，象對應的 TFA 的濃度分別為 0.025% ， 0.05% ，以及 0.1% 。

烯醇酶多肽消化標準

柱：多肽分離技術 BEH 300 C 18 ， 2.1X 100mm ， 1.7 μm

溶劑： A: 水， B: 乙腈， C ：異丙醇， D:1% TFA

圖 1. 溶劑組成可使用 ACQUITY UPLC H- Class 系統的 Aut o · Blend TM 功能簡易地進行調節。在本例中，肽圖譜的 TFA 最佳濃度僅僅通過改變從 D 線取得的流量百分比的變化而確定的。沒有必要制備更多瓶的溶劑，而且可花費最少的勞動測定中間值。

圖 2. 使用 ACQUITY UPLC H- Class 系統的自動混合功能從純溶劑瓶中提取純溶劑混合成溶劑混合物。

圖 1 中的色譜層析結果顯示了隨著酸濃度的變化，色譜選擇性的顯著變化。該實驗可以通過重復相同的實驗但使用遞增的異丙醇梯度進行拓展，其能夠通過運行溶劑 A （水）到溶劑 C （異丙醇）的梯度方便地實施，而溶劑 D 的濃度保持恒定，與先前實驗中的濃度一致。溶劑從乙腈變為異丙醇縮短了留柱時間 , 同時也顯著改變了選擇性。

該系統實驗評價了六種不同的流動相配方以確認最佳的肽圖譜。選擇性的改變可用于獲得混合物中的關鍵多肽的最佳分辨率。如果使用二元體系或者使用開關閥進行這些實驗，科學家們需要制備 12 瓶流動相溶液，至少需要 24 項體積量度。當采用 ACQUITY UPLC H- Class 系統時，僅使用了一種混合物，使用與三瓶純溶劑相聯系的兩種度量體積（圖 2 ）。 ACQUITY UPLC H- Class 系統可減少工作量，工作的時間，以及錯誤存在的可能性，以達到優化的分離條件。

總結

生物化學家能夠采用 ACQUITY UPLC H- Class 系統有效地開發用于定性蛋白質的肽圖譜分析方法。該系統使用便捷的四溶劑混合能力輔助用戶關注于分析的質量，使其能夠有效地開發完備的 , 可靠的分離方法。 ACQUITY UPLC H- Class 系統結合了 UPLC 分離原理和靈活的設備操作，以獲取最佳的生物分離結果。