工作流程

開發色譜分析方法通常需要耗費很多時間，而且難度很大。傳統方法通常是選擇一個優選或經常使用的溶劑、pH值、緩沖液和色譜柱組合作為開始點，然后對流動相組成進行 調節，直到摸索出滿意的方法。但此過程非常費力，而且經常得不到滿意的方法。更系統性的方法是利用良好的實驗設計和根據本大綱中描述的工作流程，高效快速開發高質量的反相色譜分析法。本方法開發工作流程包括測試方法摸索，其對如pH值、有機改性劑和色譜柱化學性質等選擇性因素進行評估，測定那些能夠通過控制選擇性從而實現所需分辨率的最有效的試驗參數，然后對摸索試驗得到的最優分離方案進行優化或微調以得到最終分析方法，然后對分析方法進行驗證以確保滿足預期方法目標。



開始點

為了設計一個有效的測試方法摸索試驗，盡可能多地搜集關于樣品和被分析物化學特性的信息是很重要的。

方法開發所需信息
· 樣品溶解性能
· 化學結構
· 被分析物數量
需要分離多少分析對象色譜峰？
· 功能基團：被分析物有何區別？
有無可電離基團？電離常數？
pH值如何影響色譜分析？

·檢測
需要或可能采用何種檢測？
被分析物是否有紫外吸收？
max?

· 濃度范圍和定量要求？
需要多高檢測水平？
需要多大定量限？
· 樣品基質影響
是否有阻礙分離或檢測的基質影響？

方法使用目的

在開發一種測試方法之前，還需要考慮，是否理解和明確了測試方法的目標和使用目的，清楚理解使用目的將有助于確定必須要滿足的性能參數以及驗證方法所需關鍵參數，例如可能需要從樣品的所有組分中分離一種對象被測物的方法，或者可能需要既能從其它組分中分離對象被測物、也能使所有組分之間能夠相互分離的方法，其它考慮因素可能還包括：需要多大通量？需要多大分辨率？可以接受的拖尾因子等。我們采用開發從相關化合物中分離帕羅西汀的方法來展示系統方法。

測試方法摸索

當選擇合適的色譜柱時，不同基體顆粒(雜化、硅膠、聚合物)的特性差別，會造成保留性能、選擇性的差別，了解這一點是很重要的。根據基質表面殘余的硅醇基團數量的不同以及封端原因，可能會導致次級效應，另外不同的鍵合相可導致顯著的選擇性差別以及其它特性。

不同配體、不同選擇性

·疏水性
- 更長的烷烴鏈提供更長的保留時間。
·硅醇活性
- 影響譜峰對稱性和次級效應。
·水解穩定性
- 顆粒鍵合位點上配體數量越多，色譜柱壽命越長。
·配體密度
- 影響樣品負載能力。

用傳統的HPLC設備對具有不同pH值和有機改性劑的大量色譜柱進行摸索試驗需要大量時間，而使用安裝了ACQUITY UPLC 色譜柱管理器和填充了亞-2微米顆粒的高分辨率短色譜柱的ACQUITY UPLC®設備，可使試驗從幾天縮短到幾小時。



色譜柱摸索試驗：使用安裝了ACQUITY UPLC 色譜柱管理器和ACQUITY UPLC色譜柱的ACQUITYUPLC設備測試摸索條件如圖所示，圖示這些條件的最終目標是得到一系列不同的色譜圖，其能提供選擇合適色譜柱所需信息。BEH C18色譜柱是非常好的通用C18，適于寬pH值范圍使用，BEH Shield RP18為烷烴鏈C18提供選擇性補充，BEH Phenyl色譜柱為這兩種C18色譜柱提供選擇性補充，為了滿足極性保留的試驗設計需求，也可選用HSS T3色譜柱。

pH 值的影響
·影響帶如下可電離基團等的被測物。
- 胺
- 羧酸
- 酚
·有的化合物帶一個或更多可電離基團
·pH值變化可產生最強的選擇性效果


反相保留性能：分析pH值如何影響反相色譜分析中的保留時間和穩定性是很重要的，為了得到可電離化合物的最佳保留性能，被測物不應帶電或被離子化，因此酸性被測物應該使用低pH值，堿性被測物應該使用高pH值，中性材料不帶可電離基團，因此不受pH值影響。這些曲線也可被看作滴定曲線，其拐點是分子的表觀pKa值，因為pH值的微小變化就能導致保留時間和選擇性的急劇變化，所以測試方法采用的pH值不能位于分子pKa附近，穩定區域是曲線的水平位置部分。


pH值選擇和色譜柱選擇：此色譜圖中，由于帕羅西汀及其相關化合物的帶電狀態發生變化，pH 10比pH 3在BEH C18色譜柱上的保留時間更長，在這一點上，由于具有更高分辨率和更好的選擇性，pH 10是適合被測物的pH值。下一步是評估在相同pH 10值下三種不同色譜柱的色譜圖，以選擇具有最佳分辨率的色譜柱。與其它純硅膠色譜柱相同，HSS T3色譜柱只能用于pH值2-8環境下，因此不在評估之列，三種色譜柱都顯示了可檢測所有組分的能力，由于C18的通用性，因此選擇BEH C18色譜柱來對比不同有機改性劑的選擇性。

選擇有機改性劑

用于反相分離的典型溶劑是甲醇和乙腈，除了通用性外，還具有良好的化學特性，兩者的洗脫能力和粘度不同，甲醇中存在氫鍵，具有不同的獨特選擇性。
·甲醇
- 弱洗脫劑
- 帶氫鍵溶劑
·乙腈
- 非質子溶劑
- 強洗脫劑
- 低粘度

選擇溶劑：如上色譜圖顯示，甲醇是比乙腈更弱的洗脫劑，因此表現更長的保留時間，而乙腈對此類被測物中的所有組分具有更好的分離性能，因此采用BEH C18色譜柱和乙腈溶劑在pH值為10的條件下繼續優化分離。

測試方法優化

可通過對參數進行調節以微調和優化分離過程，物理參數-梯度坡度可用于調節保留性和選擇性，但需要記住的是梯度坡度經常是分辨率和選擇性的綜合平衡結果。另一個可優化參數是溫度，任何化學過程都受溫度影響，溫度不同可導致選擇性的巨大差別。



色譜分析方法開發：當相關化合物濃度降低時，帕羅西汀相關化合物B和D的分辨率會急劇降低，這是由于其和帕羅西汀峰的濃度水平不相稱造成的，需要繼續優化。

方法優化和梯度坡度

·更小的梯度坡度可提高分辨率
- 降低梯度坡度將降低靈敏度。
·更陡的梯度坡度將壓縮譜峰，經常會降低分辨率。
- 增加梯度坡度將增加靈敏度。
·改變梯度坡度需要平衡譜峰高度和靈敏度。
·保留性能和選擇性的變化。

方法優化和溫度

·降低移動相粘度。
·降低背壓。
- 如果流動速度維持恒定。
·改善被測物分散性。
- 優化線性速度更高。
·保留性能和選擇性的變化。

溫度會影響中間的每一個化學過程，例如增加溫度會降低移動相的粘度，如果流動速度恒定將導致系統背壓降低，高溫將改變固定相和流動相之間的分配速率，然而由于提高了被測物分散性，會加快優化線性速度。對溫度變化敏感的化合物，溫度的微小變化都會導致選擇性發生獨特變化。



色譜分析方法優化：此例子中，溫度以15°C的步幅從30°C開始上升到40°C和60°C，隨著色譜柱溫度增加，組分的分離性能改善，另外被測物的分散性提高，譜峰更尖銳，色譜柱溫度為60°C時分離效果最佳。

方法驗證和注意點

方法驗證用于確認分析方法的特性能否滿足應用要求，驗證過程中需要評估的典型色譜法特性是專屬性、線性、范圍、檢測限、定量限、準確度、精度、耐用性。

分析方法驗證經常是由多個步驟組成的反復人工過程，需要進行大量的色譜測試，以充分評估所有八種特性，審視、計算和管理這些過程獲得的所有數據可能具有一定的難度。EmpowerTM 2 Method Validation Manager采用自動化的驗證過程，使數據審視更加順暢，極大提高了驗證過程的效率和可靠性。通過使用包括摸索試驗和優化的方法開發系統策略可明顯提高色譜測試方法的開發效率。設計試驗研究包括影響選擇性的多個參數，例如固定相、pH值、有機改性劑，自動化運行極大加速了測試方法開發流程。

合理審視數據后，完成最終測試方法經常是微調和優化如梯度坡度和溫度等變量的過程。為了保證所開發的方法能夠滿足應用要求，需要使用事先確定的性能參數對方法進行驗證。

驗證結果：使用Empower 2 Method Validation Manager對帕羅西汀方法的驗證結果如下：