Tonya Pekar Second, Justin Blethrow, Jae C. Schwartz, Vlad Zabrouskov, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA

關鍵詞：
LTQ Velos 線性離子阱，蛋白質學，蛋白鑒定，肽測序、靈敏度、蛋白質組發現者

引言：
對于一個蛋白質組全面的了解是研究動態蛋白質組的基礎。蛋白質的鑒定是需要有效、穩定可靠的方法。串聯質譜尤其是線性離子阱和基于阱的雜交質譜儀日益成為肽段和蛋白質鑒定的首選。選擇此類儀器的主要原因在于該類儀器具有良好的穩定性、重現性、易用性以及良好的一級和二級譜圖質量。

在一個蛋白質組體系里，經常會存在一些低豐度不易被質譜儀鑒定到的蛋白，其中某些蛋白還會存在一些動態修飾，就更難被儀器檢測到。因此，需要發展更先進靈敏度更高的一切來應對復雜蛋白質組蛋白鑒定的需求。
本篇應用論文主要介紹了用新型雙壓線性離子阱質譜儀分析復雜、Caenorbabditis elgans(C.elegans)的肽段混合物。比較了新型雙壓線性離子阱質譜儀與線性離子阱和廣泛應用的四級桿-飛行時間質譜儀的性能。

儀器創新
在本篇文章主要測試Thermo Scientific 的LTQ Velos離子阱質譜儀。它包括了一個新型雙壓線性離子阱和高壓環形離子導入裝置（S-Lens），如圖1所示。

S-lens的射頻顯著提高了離子注入到質譜儀中，這降低了在線性離子阱中離子累積所需要的時間。

雙壓阱的第一個池的壓力比以前線性離子阱的壓力要高，大約在5×10-3Torr，這能夠顯著提高目標離子的捕獲效率、分離效率和碎裂效率。提高的分離效率顯著降低了前體離子所需要的時間，所需時間是從前的四分之一。LTQ Velos離子阱對于在有高豐度干擾離子背景下低豐度前體離子具有較好的選擇性，提高了二級質譜分析的動態范圍。高壓也縮短了碰撞誘導解離所需的時間的67%，同時保持了同樣的碎裂效率。第二個池保持較低的壓力，大約在4×10-4Torr，可以以較高的分辨率進行快速質量分析。

高捕獲效率
高裂解效率
高分離效率
5 × 10-3 氦氣
高分辨率、掃描速度
3.5 × 10-4 氦氣

圖一 LTQ Velos 質譜儀 ，高壓環形離子導入裝置（ S-Lens ）和 新型雙壓線性離子阱（不同壓力控制）

與新型雙壓線性離子阱協力合作，在典型的數據依賴模式的串聯質譜實驗中，在阱里一種新型控制離子累積的方法能顯著提高實際的掃描速率。這個功能叫做“預測 AGC ”，去除了每一次串聯質譜掃描所做的預掃，基于離子流出和前一次一級質譜全掃描的母離子的相對強度，預測了離子累積所需要的時間。

實驗

樣品制備

C.elgans 勻漿液的可溶性部分用 pH7.8 的碳酸氫銨稀釋，加入 0.1% 的 RapiGest 表面活性劑，解釋用二硫蘇糖醇在 100 ℃ 還原二硫鍵，并用碘乙酰胺對半胱氨酸烷基化。樣品解釋用對 K/R 特異性酶酶切 4 個小時。酶解物質酸化后存放至 -80 ℃ 。在進入反相高效液相色譜 - 串聯質譜前用 0.1% 的甲酸稀釋。

液相色譜 - 串聯質譜分析

為了比較和評估性能，在 Thermo Scientific 的 LTQ XL 線性離子阱質譜儀和安捷倫 6520 四級桿 - 飛行時間質譜儀一級 LTQ Velos 雙壓線性離子阱質譜儀對 C.elegans 的蛋白酶解物進行了分析，肽段混合物是在反相色譜進行分離的。詳細的色譜條件請參照表 1 。同時對減少進樣量進行了考察。

在所有實驗中，均采用數據依賴的串聯質譜采集方法。在每一臺儀器上至少運行 3 次樣品。

對于線性離子阱的數據依賴模式檢測方法，該方法主要分析十個最強的離子，根據色譜峰的峰寬，優化排除條件，色譜峰的峰寬主要是根據反相梯度長度變化。由于在 LTQ Velos 質譜儀離子源有較好的離子傳輸，因此一級質譜全掃描需要較低的最大注射時間。在進行二級質譜掃描的時候，可用同樣的最大注射時間，這樣可以捕獲更多的例子，進而鑒定得到低豐度的肽段（前體離子豐度較低， AGC 的注射時間達到最大）。在 LTQ Velos 前體離子的選擇上采用數據依賴的模式，對一級質譜信號設置更高的閾值。離子轉移管的溫度為 250 ℃ ，比 LTQ XL 更高，目的是補償短的毛細管長度。碰撞誘導解離的時間從 30ms 降至 10ms ，充分利用更高的壓力池，提高碎裂效率。 LTQ Velos 雙壓離子阱對于正常掃描模式同時提供了碎裂效率和掃描速率，而且阻止了單電荷的前體離子的傳輸。在數據采集模式充分利用了這個特點，詳細的采集參數如表 2 所示。

6520 四級桿飛行時間質譜儀（ Q-TOF ）的采集參數如表 3 所示。采用了 3Hz 和 6Hz 的掃描速率，以最大化實現對肽段進行鑒定，實際有效的掃描速率為 2.5Hz 或 5.1Hz 。參數設置參考了安捷倫的技術支持，同時也與推薦文獻報道相類似。

數據庫搜索

通過用 Thermo Scientific 蛋白質組學發現 1.0 （ Proteome Discovery) 軟件和英國倫敦 Matrix Sciences 公司的 Mascot2.1 搜索引擎對數據進行檢索，比較離子阱和四級桿 - 飛行時間質譜儀所采集的數據。用于數據庫搜索的條件如表 4 所示。在 Mascot 中選中反相庫檢索選項，對所有的數據進行過濾，保證 1% 或更低的的假陽性率。用安捷倫的軟件 Masshunter 將 6520 的四級桿 - 飛行時間質譜儀所采集的數據轉換為 mzdata 格式，然后提交到蛋白質組學發現（ Proteome Discovery) 軟件。 Proteome Discovery 軟件會自動計算期望得分（或肽得分，如果選中的話）來過濾數據，達到滿足特定的假陽性率，然后將該過濾方法應用到數據集中。

因此，選擇高置信度的肽段過濾條件來使最終檢測到的蛋白滿足 1% 或更低的的假陽性率。將數據庫檢索得到的特異性肽段的數量和蛋白數進行比較。

儀器	Thermo Scientific 離子阱	Q-TOF （四級桿 - 飛行時間質譜）
HPLC （高壓液相色譜）	Thermo Scientific Surveyor MS Pump	Agilent 1200 Series HPLC
離子源	Nanospray I	Agilent HPLC-Chip/MS System
分析柱	Michrom Magic C18AQ packed tip 150 mm x 75 μm I.D. x 15 μm tip 5 μm particle, 250 ?pore size	Agilent Protein ID Chip #3 (up to 4 μg capacity) SB-ZORBAX C18 150 mm x 75 μm I.D. 5 μm particle, 300 ?pore size
流速	~ 300 nL/min at 50% organic	300 nL/min
梯度	2-25% acetonitrile in 0.1% formic acid(either 60 minutes or 180 minutes)	5-30% acetonitrile in 0.1% formic acid(either 60 minutes or 180 minutes)

表 1 肽段一維反相色譜分離條件

質譜儀	LTQ Velos	(LTQ XL)
毛細管溫度	250 °C	( 200 °C )
離子源參數	S-Lens 40%	(Tube Lens 100 V)
AGC Targets Full	MS: 3e4
	MSn: 1e4
最大注射時間	一級質譜 : 10 msec (Full MS: 50 msec)
	多級質譜 : 100 msec
一級質譜掃描范圍	400 -1200 m /z
隔離寬度	2 m /z
碰撞類型	CID 碰撞誘導解離
歸一化能力	30%
碰撞時間	10 msec		(30 msec)
缺省帶電量	3
DDA 選擇閾值	1000		(10,000)
方法	Top 10 most intense DDA
Number of Microscans	1
掃描速率	正常
排除 單電荷	是		否
動態排除功能	Exclusion duration: 排除周期 15 sec (60 min), 30 sec (180 min) List size: 500
	Repeat count: 1 Mass width: low-1.0, high 1.5

表 2 ： LTQ Velos and LTQ XL 質譜 儀采集參數

質譜儀	Agilent 6520 Q-TOF
ESI 條件	HPLC-Chip NSI Interface
芯片氣體溫度	300 °C
干燥器溫度	4 L /min
一級質譜采集頻率	3, 6, or 8 Hz
二級質譜采集頻率	3 or 6 Hz
一級質譜掃描范圍	200 -2000 m /z
碰撞能力	Slope: 3 V
	Offset: 2 V
方法	Top 6 DDA
	Precursors sorted by abundance 按照豐度排序前體離子
帶電量選擇	拒絕單電荷
動態排除	Duration: 30 秒 (60 min),
	60 秒 (180 min)
	Repeat count: 1

表 3 四級桿 - 飛行時間質譜儀采集參數

軟件平臺	Proteome Discoverer
搜索引擎	MASCOT v 2.1
數據庫	NCBI, April 2008
最大漏切數目	1
前體離子容忍度	離子阱數據 : 1.4 Da
	四級桿飛行時間質譜數據 : 40 ppm
碎片容忍度	離子阱數據
	四級桿飛行時間質譜數據 : 100 mmu
蛋白質量	不限制
反庫搜索	使用
儀器類型	離子阱數據 : ESI-TRAP
	四級桿飛行時間質譜數據 : ESI-Q-TOF
修飾	固定修飾 : 半胱氨酸烷基化
得分	MUDPIT scoring
	蛋白 cut-off: 20
	肽 cut-off: 10
DTA 產生條件	總離子強度閾值 : 100
	最小離子數 : 10
	信噪比閾值： 2 前體離子范圍 700 -5000 m /z ( 離子阱 ), 700 -7000 m /z ( 四級桿 - 飛行時間質譜 )

Table 4: 數據分析數據庫搜索條件

結果與討論

LTQ Velos 比 LTQ XL 和 Q-TOF 鑒定到了更多的特異性肽段

圖 2 ： 1ug C.elegans 酶解樣品在 60 分鐘內運行色基峰色譜圖比較（上圖為 LTQ Velos 雙壓離子阱質譜儀，下圖為四級桿飛行時間質譜儀）

與線性離子阱 LTQ XL 和四級桿 - 飛行時間質譜儀 Q-TOF 相比， LTQ Velos 雙壓離子阱質譜儀從 C.elegans 的胰酶酶解物中鑒定得到了更多的特異性肽段。有更多的蛋白被鑒定到。圖 2 顯示的是在 60 分鐘的梯度內用反相色譜 -LTQ Velos 質譜儀得到的基峰色譜圖，以及用 1200 高效液相色譜 - 芯片分離 - 四級桿飛行時間質譜一得到基峰質譜圖。在 60 分鐘的分離過程， LTQ Velos 質譜儀比 LTQ XL 質譜儀多鑒定了 67% 的特異性肽段，比 Q-TOF 多鑒定了 165.7% 的特異性肽段，上述結果都是在 3Hz 情況下得到的。在相同的實驗過程中， LTQ Velos 離子阱鑒定到蛋白的數目比四級桿 - 飛行時間質譜儀 Q-TOF 多了 240% 。在實驗中，鑒定到的蛋白和特異性肽段的數目都是三次重復實驗取的平均值，而且相對標準偏差小于 10% 。每一次運行樣品，平均百分比都增加了，但并不是所有重復數據都增加了。

圖 3 樣品： 1ug C.elegans 蛋白胰酶酶解物 在反相色譜分離。 LTQ Velos 雙壓離子阱比 LTQ XL 離子阱和四級桿 - 飛行時間質譜儀能鑒定到更多的特異性肽段和蛋白。圖中所示為兩個梯度的結果，也標出了每一個儀器的實際采樣速率。

如圖 4 所示，在不同儀器之間，有很多蛋白會重復出現，即被不同儀器同時鑒定到。在 60 分鐘的分離過程中， LTQ Velos 雙壓離子阱鑒定到了 LTQ XL 得到到蛋白數目的 88% ， LTQ Velos 雙壓離子阱鑒定到了 Q-TOF 得到蛋白數目的 90% ，此外，還有 570 個蛋白沒有被其他儀器鑒定到，大約占 53% 。因此， LTQ XL 和 Q-TOF 鑒定到的蛋白大部分都被 LTQ Velos 鑒定到，而且還有許多上述兩儀器沒有鑒定到的。在 LTQ Velos 反復對同一樣品進行分析的時候，能重復鑒定到的蛋白超過 70% ，而且有 85% 的蛋白能過被鑒定到兩次或三次，說明 LTQ Velos 的重現性較好 .

圖 4 1ug C.elegans 蛋白胰酶酶解物在 60 分鐘內用反相色譜分離，不同儀器鑒定到的蛋白。（ 1% 假陽性率）

/	LTQ XL	LTQ Velos	增加百分比
信號轉導蛋白	21	49	133%
激酶	11	24	118%
磷酸酶	15	31	107%

表 5 用 LTQ Velos 離子阱比 LTQ XL 離子阱能鑒定得到更多的信號轉導蛋白

LTQ Velos 有更好的靈敏度

在復雜混合物中，由于低豐度的前體離子存在于寬動態范圍的背景基質中，需要很好的靈敏度（很強的信號），而且需要好的選擇性，目標離子的選擇效率以及能應對復雜體系的采集速度。 LTQ Velos 質譜儀對于在高度復雜背景下關鍵低豐度蛋白的檢測有更好的靈敏度。用 Proteome Discovery 軟件對檢索得到的蛋白結果進行注釋，如功能，亞細胞位置等。這些信息來源于公共的蛋白數據庫（如 Swissprot 和 NCBI ） , 在 180 分鐘的梯度運行一次目標樣品，將檢索到的蛋白進行分類， LTQ Velos 雙壓離子阱比 LTQXL 多檢出了 133% 的信號轉導蛋白，而且多檢測了兩倍數目的激酶和磷酸酶。

此外，只有 LTQ Velos 雙壓離子阱鑒定到了低豐度的的轉錄因子 ntl-3 ，它主要參與生長調控，還鑒定到了 F4369 主要參與細胞定位。

為了進一步證明 LTQ Velos 雙壓離子阱對于分析低豐度化合物的能力，比如在組織或細胞里天然豐度較低的蛋白或肽段，樣品被稀釋了 50 倍，在兩臺線性離子阱上進行分析，由LTQ Velos 雙壓離子阱 鑒定得到的特異性肽段比 LTQ XL 多 152% ，主要是由于 LTQ Velos 雙壓離子阱有高靈敏的二級質譜鑒定能力，有更好的離子傳輸效率，對于弱的前體離子信號， LTQ Velos 雙壓離子阱能在有限的最大注射時間內傳輸更多的離子到阱內，因此提高了二級質譜的靈敏度， LTQ Velos 雙壓離子阱由較快的掃描速率，也增加了低豐度的前體離子被鑒定到的幾率。

圖 5 20ng 進樣量 60 分鐘的色譜梯度 LTQ Velos 雙壓離子阱比 LTQ XL 離子阱能增加對低豐度蛋白鑒定的量。

LTQ Velos 雙壓離子阱提高實驗通量

快速的掃描速率，不但提高了儀器工作循環的次數，同時也縮短了色譜分離時間，提高了實驗的通量，對于同一個復雜混合物， LTQ Velos 雙壓離子阱在 60 分鐘內鑒定到的特異性肽段比 LTQ XL 離子阱在 180 分鐘內鑒定到的還要多，因此，對于簡單而又有寬動態范圍（如膠條帶）的混合物分析，可以顯著提高其通量。對于某些需要多次重復的實驗，如方法開發，或涉及生物樣品重復的實驗，用此儀器就非常方便快捷。同樣對于定量試驗，用 LTQ Velos 雙壓離子阱也具有很大的優勢，因此它有較快的掃描速度，更多的掃描次數，可以對較窄的色譜峰進行多個數據點的采集，因此適用于超高壓液相色譜分離和短運行時間的分析實驗。

為什么四級桿飛行時間質譜儀（ Q-TOF ）儀器鑒定的蛋白較少

對來源于 Q-TOF 儀器的數據進行詳細分析，一級質譜全掃描的譜圖質量與 LTQ Velos 幾乎相當，而且信噪比和譜圖特征也很類似，而且 Q-TOF 有更好的質量準確度（在 1% 假陽性率鑒定到的肽的 RMS 有 9PPM ），結果顯示，在一定的分析時間內如 60 分鐘，對于肽段鑒定的實驗來說，全掃描的靈敏度、動態范圍、或質量準確度不是決定因素，掃描速率可能是一個決定性因素，隨著分離時間延長，掃描速率影響不是特別大，但肽和蛋白鑒定數目也提高了，如圖 3 所示。對于掃描速率的詳細討論，請參考下面的 Q-TOF 掃描速度對靈敏度的影響。

由 LTQ Velos 雙壓離子阱鑒定到的前 20 個蛋白的 Mascot 平均得分為 1113.4 ，在 3Hz 掃描速度工作下的 Q-TOF 前 20 個蛋白平均得分為 506.7 ，前者是后者的一倍還多。 Q-TOF 的二級質譜圖質量較差，導致了較少的肽段被鑒定到。 Q-TOF 一級質譜和二級質譜的高質量準確度并沒有彌補低質量的二級質譜譜圖。如，與線性離子阱獲得的質譜圖相比，有較少的序列離子，當檢索參數設置為 MS1.4Da MS/MS 0.8 ，離子阱的二級質譜掃描譜圖質量已經夠高，結果顯示，線性離子阱（ LTQ ）系統比四級桿 - 飛行時間（ Q-TOF ）在蛋白鑒定更具優勢。

圖 6 1ug C.elegans 蛋白胰酶酶解物在反相色譜分離的基峰圖，四級桿飛行時間質譜和 LTQ Velos 線性離子阱全掃描動態范圍的比較

Q-TOF 掃描速率對靈敏度的影響

如圖 7 所示，將 Q-TOF 掃描速率從 3Hz 升至 6Hz ，導致鑒定到肽段數目減少，這主要是因為隨著 Q-TOF 質譜儀的掃描速率提高，一級質譜圖特別是二級質譜圖質量下降。增加的掃描速度減少了離子的傳輸時間，由于較少的離子被檢測到和平均化，因此降低了譜圖的信噪比。如圖 8 所示，將 Q-TOF 掃描速率從 3Hz 升至 8Hz ，損失了 66% 的 Q-TOF 信號，在二級質譜圖可檢測到的特征離子數目減少了。

增加的 MS/MS 采集的掃描速率，降低了二級質譜圖的質量和信噪比，而且 Mascot 鑒定到的肽段的得分也受影響，如圖 9 所示，二級質譜圖掃描幾乎來源于色譜峰的頂點。在高質量 Q-TOF3Hz 譜圖下， Mascot 得分為 49 分，而且 LTQ Velos 雙壓離子阱對于同一樣品，進樣量只有 Q-TOF80% 的時候， Mascot 的得分為 103 分，前者比后者低了 53% ，當 Q-TOF 在 6Hz 運行時，對于 1 μ g 的樣品在 180 分鐘的運行時間內，鑒定到的肽段數目下降了 40% ，這就是為什么盡管儀器的掃描速率可以達到 10Hz ，在做肽段鑒定實驗過程中，廠家不建議其采樣速率超過 3Hz 的原因。

擁有專利技術的 pAGC ，在阱內可實現離子累積， LTQ Velos 雙壓離子阱不管前體離子的峰強度，對于二級質譜的離子數目進行優化，結果顯示，在 180 分鐘的梯度內，在實際掃描速率為 6.3Hz 運行下的 LTQ Velos 雙壓離子阱比 6Hz 運行下的四級桿飛行時間質譜（ Q-TOF ）多檢測到了 282% 個特異性肽段。

圖 7 1ug C.elegans 蛋白胰酶酶解物在 180 分鐘內用四級桿 - 飛行時間質譜儀（ 3Hz 和 6Hz ）和 LTQVelos 線性離子阱鑒定到特異性肽段數目的比較

圖 8 在 Q-TOF 儀器上比較不同質譜掃描速率下信號的強度

圖 9 四級桿 - 飛行時間質譜在兩個不同二級質譜掃描速率下，對同一個二價前體離子 LVGDLDDAQVDVER 二級質譜圖的比較。而 LTQ Velos 離子阱對同一前體離子檢測只用了 80% 的樣品量。

結論：在一個復雜的蛋白質組樣品中，高靈敏的檢測和鑒定化合物對于了解和認知動態蛋白質學具有極其重要的意義。隨著技術的革新， LTQ Velos 雙壓線性離子阱質譜儀的出現，，大幅度提高了肽段和蛋白鑒定的個數，與當前主流的技術相比， LTQ Velos 雙壓線性離子阱質譜儀由于其超高的采集速度和高的靈敏度，增加了低豐度的前體離子的鑒定數目。

•  在一個復雜混合樣品中， LTQ Velos 離子阱比四級桿 - 飛行時間質譜能多鑒定 240% 個蛋白質和 130% 個特異性肽段，而且，通過四級桿 - 飛行時間質譜鑒定到的蛋白，有 90% 以上都能在 LTQ Velos 看到。

•  LTQ Velos 雙壓線性離子阱對于低含量的物質有較高的靈敏度。上樣量在 20ng 的時候，與 LTQ XL 離子阱相比， LTQ Velos 雙壓線性離子阱對于特異性肽段的鑒定增加了 150% 。

•  隨著鑒定蛋白數目的增多， LTQ Velos 雙壓線性離子阱給出了更多的低豐度的蛋白，在這里面，對與信號轉導蛋白的量提高了 133% 。

•  LTQ Velos 雙壓線性離子阱提高了實驗的通量，對于復雜樣品的分離，比 LTQ XL 離子阱在三分之一的分離時間里，鑒定了更多的蛋白和肽段。

•  相比四級桿 - 飛行時間質譜儀，在線性離子阱中能得到更高質量的二級質譜圖，這樣在 Mascot 檢索中能得到更高的分數。通過四級桿 - 飛行時間質譜儀得到高質量準確度的圖對于肽段的鑒定是有益的但還不夠。

•  提高四級桿 - 飛行時間質譜儀的掃描速度會降低一級質譜和二級質譜圖的信號和譜圖質量，同時導致減少鑒定到肽段的數目。

參考文獻

•  Horn, D.M., Miller, C.A. , Miller, B.D. The Effect of MS/MS Fragment Mass Accuracy on Peptide Identification in Shotgun Proteomics. Application Note 5989-7820 EN. www.agilent/chem/proteomics

感謝

感謝華盛頓大學基因科學系 Gennifer Merrihew 提供 C.elegans 樣品。
賽默飛世爾科技公司 版權所有
Aglient 和 Mass hunter 是安捷倫科技公司的的注冊商標
Mascot 是 Matrix Science 有限公司的注冊商標
所有其他的商標均為 賽默飛世爾科技公司和子公司的商標。
價格和技術指標可能會有改變，請咨詢當地的銷售代表獲得詳細的資訊。
或者訪問 Thermo Scientific 液質聯用的應用 www.thermo.com/appnotes
來源：Thermofisher Scientific