非損傷微測技術及其在細胞生物學研究中的應用

——（1）技術簡介

作者：旭月（北京）科技有限公司 美國揚格非損傷技術中心

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摘要：非損傷微測技術是一種選擇性微電極技術，可以不損傷樣品而獲得進出樣品的離子和分子信息，具有非損傷性，長時間、多電極、多角度測量等優勢。本文介紹非損傷微測技術原理和技術特點及其在細胞生命科學不同領域的應用。

關鍵詞：非損傷微測技術，離子和分子選擇性微電極，活細胞測量

非損傷微測技術（Non-invasive Micro-test Technique, NMT）或稱無損微測技術，是一種選擇性離子和分子檢測技術，誕生于1990年 ^[1]。非損傷微測技術因其獨有的測量方式逐漸應用到生命科學的諸多領域。

1. 非損傷微測技術簡介

非損傷微測技術是由電腦自動控制離子和分子選擇性微電極，在不接觸活體樣品的情況下，獲得進出樣品的各種離子和分子濃度、流速及其三維運動方向的信息。圖1展示了一套完整的非損傷微測系統。

目前，非損傷微測技術可以測量H⁺，Ca²⁺，K⁺，NH₄⁺，Al³⁺，Na⁺，Cd²⁺，NO₃^-，Cl^-及O₂，CO₂，NO，氨基酸等五十多種離子和分子，為獲得生物樣品離子和分子信息提供了良好的實驗平臺^[2，3]。被測樣品可以是單細胞、細胞層、組織、器官甚至整個生物體。測量方便、快捷、三維和實時，對樣品不會產生任何傷害，從而獲得其他技術難以測到的生理特征和生命活動規律，在理論研究和應用領域方面產生前所未有的重大突破。

非損傷微測技術具有非損傷性，長時間、多電極、多角度測量等優勢。值得一提的是，非損傷微測技術是目前世界上惟一能夠按照研究人員的設定，以手動或編程的方式，從任意角度（相對于樣品表面）對樣品進行測量的系統。

2. 非損傷微測技術原理

圖2是離子選擇性電極工作原理示意圖。離子選擇性電極由玻璃微電極、Ag/AgCl導線、電解質及液態離子交換劑(liquid ion exchanger，LIX)四部分組成。該電極在待測離子濃度梯度中以已知距離dx進行兩點測量，并分別獲得電壓V₁和V₂。兩點間的濃度差dc則可以從V₁，V₂及已知的該電極的電壓/濃度校正曲線計算獲得。D是離子/分子特異的擴散常數(單位:cm^-2·sec^-1)，將它們代入Fick第一擴散定律公式：J_o = - D· dc/dx，可獲得該離子的移動速率(單位：pmol·cm^-2·sec^-1)，即每秒通過一平方厘米的該離子/分子摩爾數。

3. 非損傷微測技術的應用

   非損傷微測技術能在細胞和組織水平上的功能鑒定方面以及跨膜生物信息傳遞機制等方面發揮重要的作用^[3]。例如，葡萄牙里斯本大學Feijo實驗室^[4]使用激光共聚焦顯微鏡測細胞內Ca²⁺的同時利用非損傷微側技術測量外部的Ca²⁺。由圖可以看到，當融合開始時，非損傷微測技術測得一個明顯的Ca²⁺內流，直接驗證了胞內Ca²⁺的增加主要是由于吸收胞外Ca²⁺而非內源鈣釋放引起。因此，非損傷微測技術在直接獲得細胞或組織外部離子和分子信息方面，具有明顯的優勢。

 圖3 使用激光共聚焦顯微鏡測細胞內Ca²⁺的同時利用非損傷微側技術測量外部的Ca²⁺

  目前在生物醫學領域使用非損傷微測技術的部分機構有：美國麻省州立大學，美國肯薩斯州立大學，加拿大Montreal大學，加拿大McMASTER大學，葡萄牙里斯本大學，德國慕尼黑大學，澳大利亞悉尼大學，新西蘭農業草地（研究所），中科院植物所，中科院遺傳與發育生物學研究所，北京大學生科院，中國農業大學動物醫學院，廣東暨南大學醫學院等。

    非損傷微測技術在可興奮細胞、細胞凋亡、上皮細胞和內皮細胞研究及神經系統、胚胎發育、新陳代謝、毒理學、腫瘤研究等領域具體應用實例將在隨后五期里分別介紹。

參考文獻

[1] Kuhtreiber W M, Jaffe L F. Detection of extracellular calcium gradients with a calcium-specific vibrating electrode. J Cell Biol. 1990,110(5):1565-1573.

[2] 印莉萍, 上官宇, 許越. 非損傷性掃描離子選擇電極技術及其在高等植物研究中的應用. 自然科學進展. 2006, 16(3):262-266.

[3]丁亞男,許越.非損傷微測技術及其在生物醫學研究中的應用.物理. 2007, 36(7): 548-558.

[4] Antoine AF, Faure JE, Dumas C, Feijó JA. Differential contribution of cytoplasmic Ca²⁺ and Ca²⁺ influx to gamete fusion and egg activation in maize. Nat Cell Biol. 2001, 3(12): 1120-1123.