一、實驗目的：
酶聯(lián)免疫吸附試驗是免疫酶技術的一種，免疫酶技術屬于三大標
記技術之一，掌握該試驗的原理和主要技術，了解三大標記技術的異同及各自的主要應用。

二、實驗原理：
酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是應用酶標記的抗體（或抗原）在固相支持物表面檢測未知抗原（或抗體）的方法。酶與抗體（或抗原）交聯(lián)后，再與集合結合在固相支持物表面的相應抗原或抗體反應，形成酶標記抗體-抗原復合物，此時加入酶底物和顯色劑，在酶催化底物液體后呈現(xiàn)顯色反應，液體顯色的強弱和酶標記抗體-抗原復合物的量成正比，借此反映出待檢測的抗原或抗體量。

酶聯(lián)免疫吸附試驗是利用抗原-抗體的免疫學反應和酶的高效催化底物反應的特點，具有生物放大作用，所以反應靈敏，可檢出濃度在ng水平。在免疫反應部分，抗原-抗體的親和力、抗原和半抗原的性質(zhì)、測定方法的實驗條件、酶標記物的性質(zhì)等因素影響反應的敏感性。在酶學反應部分，酶的濃度、底物的濃度、反應pH和溫度、酶的抑制劑和激活劑等因素液影響反應的敏感性。

酶聯(lián)免疫吸附試驗中所使用的試劑都比較穩(wěn)定，按照一定的實驗程序進行測定實驗結果重復性較好，有較高的準確性。酶聯(lián)免疫吸附法成本低，操作簡便，可同時快速測定多個樣品，不需要特殊的儀器設備。ELISA法測定技術與其他技術結合發(fā)展成為專門的分析方法，如與電泳技術結合的免疫印跡技術，與層析技術結合的層析-ELISA技術等已成為生物實驗室的常規(guī)技術。

三、試劑與器材：
1. 聚苯乙烯微量細胞培養(yǎng)板(平板, 48, 96孔)。
2. 酶聯(lián)免疫檢測儀
3. 辣根過氧化物酶羊抗兔IgG, 工作稀釋度1:1000。
4. 包被液:：0.05mol/L pH9.6碳酸緩沖液,4℃，保存,　Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸餾水稀釋至100 ml。
5. 稀釋液：0.01mol/LpH7.4 PBS--Tween--20, ４℃，保存. NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H2O 2.9g, Tween—20，0.5ml. 蒸餾水加至1000ml。
6. 洗滌液：同稀釋液
7. 封閉液：0.5%雞卵清蛋白，pH7.4 PBS。
8. 鄰苯二胺溶液(底物)：臨用前配制 0.1M 檸檬酸(2.1g/100ml), 6.1ml 0.2M Na2HPO4.12H2O　(7.163g/100ml)　6.4ml, 蒸餾水12.5ml, 鄰苯二胺10mg, 溶解后, 臨用前加30%H2O2 40 微升。
9. 終止液：2mol/LH2SO4。

四、操作方法：
1.包被抗原：用包被液將抗原作適當稀釋, 一般為1～10微克/孔，每孔加200微升，37℃溫育1小時后，4℃冰箱放置16～18小時。
2. 洗滌：倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜放三分鐘，反復三次，最后將反應板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡。
3. 加封閉液200微升，37℃放置一小時。
4. 洗滌同2。
5. 加被檢血清：用稀釋液將被檢血清作幾種稀釋,，每孔200微升。同時作稀釋液對照。37℃放置2小時。
6. 洗滌同2。
7. 加辣根過氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃ 1小時。
8. 洗滌同2。
9. 加底物：鄰苯二胺溶液加200ml，室溫暗處10--15分鐘。
10. 加終止液：每孔50微升。
11. 觀察結果：用酶聯(lián)免疫檢測儀記錄490nm讀數(shù)。

五、關鍵步驟與注意事項：
1、酶標記抗體以及待檢樣本的使用濃度應事先滴定
2、保存的血清切忌反復凍融，以免降低血清中抗體或抗原的免疫學活性。
3、酶-底物反應時間除人為規(guī)定（常規(guī)規(guī)定為30分鐘）外，還可以陽性參考標本的OD值達到1.0時為反應終點。
4、底物液一定要在臨用前現(xiàn)配。