超維景助力北京大學微型化三光子顯微鏡問世

瀏覽次數：1687　發布日期：2023-3-3　來源：超維景公眾號

深腦成像的利器：超維景助力北京大學微型化三光子顯微鏡問世

2023年2月23日，北京大學程和平-王愛民團隊在Nature Methods在線發表題為 Miniature three-photon microscopy maximized for scattered fluorescence collection的文章。

文中報道了重量僅為2.17克的微型化三光子顯微鏡（圖1），首次實現對自由行為小鼠的大腦全皮層和海馬神經元功能成像，為揭示大腦深部結構中的神經機制開啟了新的研究范式。

圖1 小鼠佩戴微型化三光子顯微鏡實景圖

解析腦連接圖譜和功能動態圖譜是我國和世界多國腦計劃的一個重點研究方向，為此需要打造自由運動動物佩戴式顯微成像類研究工具。2017年，北京大學程和平院士團隊成功研制第一代 2.2 克微型化雙光子顯微鏡，獲取了小鼠在自由行為過程中大腦皮層神經元和神經突觸活動的動態圖像。2021年，該團隊的第二代微型化雙光子顯微鏡將成像視野擴大了 7.8 倍，同時具備獲取大腦皮層上千個神經元功能信號的三維成像能力。

01
微型化三光子顯微鏡突破成像深度極限

海馬體位于皮層和胼胝體下面，在短期記憶到長期記憶的鞏固、空間記憶和情緒編碼等方面起重要作用。在嚙齒類動物研究模型中，海馬距離腦表面深度大于一個毫米。由于大腦組織，特別是胼胝體，具有對光的高散射光學特性，所以突破成像深度極限是長期以來困擾神經科學家的一個極大的挑戰。此前的微型化單光子及微型化多光子顯微鏡均無法實現穿透全皮層直接對海馬區進行無損成像。

此次，北京大學最新研發的微型化三光子顯微鏡一舉突破了此前微型化多光子顯微鏡的成像深度極限：
1、顯微鏡激發光路可以穿透整個小鼠大腦皮層和胼胝體，實現對小鼠海馬CA1亞區的直接觀測記錄（圖2，Video 1-2）。神經元鈣信號最大成像深度可達1.2 mm，血管成像深度可達1.4 mm。
2、在光毒性方面，全皮層鈣信號成像僅需要幾個毫瓦，海馬鈣信號成像僅需要20至50毫瓦，大大低于組織損傷的安全閾值。因此，該款微型化三光子顯微鏡可以長時間、不間斷連續觀測神經元功能活動，且不產生明顯的光漂白與光損傷。

圖2 微型三光子顯微成像記錄小鼠大腦皮層L1-L6和海馬CA1的結構和功能動態。CC：胼胝體。綠色代表GCaMP6s標記的神經元熒光鈣信號，洋紅色代表硬腦膜、微血管和腦白質界面的三次諧波信號。

video1：這是使用北大微型化三光子顯微鏡拍攝的小鼠大腦從大腦皮層到胼胝體再到海馬CA1亞區的三維重建圖。綠色代表GCaMP6s標記的神經元熒光信號，洋紅色代表硬腦膜、微血管和腦白質界面的三次諧波信號。左上角顯示成像深度，可以看到，激光進入大腦，以硬腦膜作為0點，向下移動z軸位移臺，我們一次看到了皮層L1至L6分層的神經元胞體和微血管，之后我們看到了胼胝體致密的纖維結構。在穿過胼胝體后，我們繼續向下，我們終于看到了位于海馬CA1亞區的神經元胞體。

video2：左下圖是小鼠佩戴著微型化三光子探頭，在鼠籠(長29厘米× 17.5厘米寬× 15厘米高)中自由探索。左上圖是此時小鼠佩戴的微型化三光子探頭正在對深度為978 μm的海馬CA1亞區神經元熒光鈣信號進行成像（幀率8.35Hz，物鏡后的光功率為35.9 mW）。右圖展示了左上圖中10個神經元的鈣活動軌跡，尖峰代表鈣信號發放。鈣活動軌跡上移動的藍線與小鼠自由行為視頻同步。

02
全新的光學構型設計

北京大學微型化三光子顯微鏡成像深度的突破得益于全新的光學構型設計。（圖3）

圖3 微型化三光子顯微鏡光學構型

通過對皮層、白質和海馬體建立分層散射模型進行仿真，發現熒光信號從深層組織到達腦表面時已經處于隨機散射的狀態，使得顯微物鏡熒光收集效率降低，從而極大限制了成像深度。針對這一問題，經典阿貝聚光鏡結構被引入構型設計中：微型阿貝聚光鏡與簡化的無限遠物鏡密接可以提高散射光的通透效率；阿貝聚光鏡與激發光路中的微型管鏡部分復用，可以進一步簡化結構，降低損耗。總體上，新微型化顯微鏡的散射熒光收集效率實現了成倍的提升。

03
生物應用

同時，利用微型化三光子顯微鏡，作者研究了小鼠頂葉皮層第六層神經元在抓取糖豆這一感覺運動過程中的編碼機制：發現大約37%的神經元在抓取動作之前就開始活躍且在抓取時最活躍，大約5.6%的神經元在抓取動作之后開始活躍，說明不同神經元參與了不同階段的編碼。（圖4，Video 3）這一結果初步展示了微型化三光子顯微鏡在腦科學研究中的應用潛力。

圖4 小鼠頂葉皮層第六層神經元在抓取糖豆任務中的不同反應類型

video3：左圖是佩戴著微型化三光子顯微鏡的小鼠在0.5厘米狹縫中用手抓取糖豆吃。中間圖是此時微型化三光子顯微鏡探頭拍攝的PPC腦區皮層第6層神經元（位于650微米深度）熒光鈣信號（GCaMP6s標記的神經元，幀率15.93 Hz）。右圖是選取中間圖中5個神經元的鈣活動軌跡，其中每條綠線表示一次小鼠的抓取動作。移動的藍色線與左圖的小鼠行為視頻以及中間圖中的神經元活動同步。視頻以正常(×1)、慢速(×0.5)和快速(×10)的速度播放，以便于查看抓取行為。

北京大學未來技術學院博士后趙春竹、北京大學前沿交叉學科研究院博士研究生陳詩源、北京大學分子醫學南京轉化研究院研究員張立風為該論文的共同第一作者，北京大學程和平、王愛民、趙春竹為論文的共同通訊作者，北京超維景生物科技有限公司胡炎輝、李誼軍、陳燕川、付強、高玉倩、江文茂、張穎也參與了此項工作的開發。該項目得到科技創新2030-“腦科學與類腦研究”重大項目、中國醫學科學院醫學與健康科技創新工程—腦疾病的線粒體機制研究創新單元、國家自然科學基金委、國家重大科研儀器研制專項、科技部重點研發計劃等經費支持。

超維景一直致力于前沿生物醫學成像技術的產業轉化，為推動生命科學的研究與發展提供優質的、系統化的解決方案。

經過多年的沉淀
我們即將推出自主研發的
最新一代微型化三光子顯微成像系統
敬請期待！

Nature Methods 原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41592-023-01777-3

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