隨著國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了一批 AAV 制劑的臨床試驗(yàn)申請(qǐng)，越來(lái)越多的 AAV 制劑進(jìn)入大眾視野。AAV 制劑中病毒滴度的準(zhǔn)確定量，是影響療效的關(guān)鍵因素。因此建立準(zhǔn)確、穩(wěn)定的檢測(cè)流程對(duì)于細(xì)胞和基因治療企業(yè)來(lái)說(shuō)尤為重要。數(shù)字 PCR 作為新一代的核酸定量工具，以其絕對(duì)定量與精準(zhǔn)性高等特點(diǎn)，被細(xì)胞和基因治療行業(yè)快速接納并應(yīng)用。
  腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）是一類單鏈線狀 DNA 缺陷型病毒，需要輔助病毒（如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒）存在時(shí)，才能進(jìn)行復(fù)制。在基因治療的研究中，通常使用不需輔助病毒的重組 AAV 病毒（rAAV）將目的基因序列插入 rAAV 表達(dá)質(zhì)粒中，包裝病毒，然后直接使用 rAAV 感染細(xì)胞就能完成目的基因的插入操作。rAAV 作為基因療法載體有以下優(yōu)勢(shì)：安全性高、免疫原性低；宿主細(xì)胞范圍廣；擴(kuò)散能力強(qiáng)；體內(nèi)表達(dá)基因時(shí)間長(zhǎng)；適用種類多樣等。
 
腺相關(guān)病毒 AAV 的檢測(cè)
AAV 制劑的滴度檢測(cè)是生物企業(yè)中重要的環(huán)節(jié)，穩(wěn)定及精確的檢測(cè)結(jié)果是臨床給藥的基礎(chǔ)保障。根據(jù)現(xiàn)有的檢測(cè)手段及原理，可以將其分為物理滴度及感染滴度兩大類型。物理滴度主要是指病毒顆粒滴度及基因組滴度，感染滴度主要指目的基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度。
 
物理滴度目前的主流方法是熒光定量法（qPCR），但 qPCR 往往由于其本身的技術(shù)原因，不同批次試劑中不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線會(huì)影響其對(duì)最終濃度的計(jì)算，導(dǎo)致最終的滴度計(jì)算有所偏差。
 
達(dá)普生物提供一種更精準(zhǔn)的檢測(cè)方案 —— 微滴式數(shù)字 PCR，可以直接量化 DNA 拷貝數(shù)。這種方法具有以下特點(diǎn)：
 
1. 絕對(duì)定量：無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線，直接定量目的序列，減少實(shí)驗(yàn)復(fù)孔及標(biāo)準(zhǔn)曲線帶來(lái)的額外操作和實(shí)驗(yàn)誤差。
2. 更加準(zhǔn)確：與 qPCR 相比，數(shù)字 PCR 可以消除不同 PCR 反應(yīng)擴(kuò)增效率的不同引入的定量偏差。
3. 更加精確：實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，實(shí)際樣品測(cè)試結(jié)果 CV＜15%；且不受人為因素影響，在不同實(shí)驗(yàn)人員操作的情況下，結(jié)果均顯示較小差異。
 

	qPCR	數(shù)字 PCR
定量能力	依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線，相對(duì)定量	絕對(duì)定量
精準(zhǔn)度	好	極佳
重復(fù)性	好	極佳
抑制劑耐受情況	一般	較好
數(shù)據(jù)分析	人工劃定閾值	儀器自動(dòng)分析

 
正是由于以上優(yōu)點(diǎn)，美國(guó)藥典章節(jié) “US Pharmacopeia Standards for Cell and Gene Therapy” 中，對(duì) AAV 制劑的滴度測(cè)定推薦了數(shù)字 PCR 方法用于替代 qPCR 方法。  
達(dá)普生物 AAV 病毒核酸滴度檢測(cè)套裝
為推動(dòng) AAV 病毒滴度更加精準(zhǔn)定量，助力 AAV 制劑療法的深入研究。近日，達(dá)普生物基于星云數(shù)字 PCR 平臺(tái)，自主設(shè)計(jì)開發(fā)了 “腺相關(guān)病毒（AAV）滴度檢測(cè)試劑盒（數(shù)字PCR法）”。達(dá)普生物的星云數(shù)字 PCR 平臺(tái)搭配本試劑盒，為客戶提供從病毒制品準(zhǔn)備到結(jié)果導(dǎo)出的完整解決方案，可應(yīng)用于 AAV 生產(chǎn)制造中的質(zhì)量控制。
   
達(dá)普生物-腺相關(guān)病毒（AAV）滴度檢測(cè)試劑盒優(yōu)勢(shì)：

• 操作簡(jiǎn)便：無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線，試劑盒利用率高。
• 兼容性好：適合多種血清型檢測(cè)。
• 準(zhǔn)確性好：具有較好的靈敏度、特異性，不受部分序列二級(jí)結(jié)構(gòu)影響。
• 性價(jià)比高：數(shù)字 PCR 方法與 qPCR 方法實(shí)際耗材成本相似。
• 優(yōu)化流程：部分制品可使用免提取策略直接檢測(cè)培養(yǎng)物中的病毒滴度。

 
數(shù)字 PCR 定量檢測(cè)無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線
● 低濃度重復(fù)性較好
 
qPCR 定量檢測(cè)需要標(biāo)準(zhǔn)曲線
● 多批次，樣品少的檢測(cè)環(huán)境需要重復(fù)多次標(biāo)準(zhǔn)曲線
● 標(biāo)準(zhǔn)品需要稀釋，操作要求較高，重復(fù)性（尤其是低濃度）欠佳
 
達(dá)普生物數(shù)字 PCR 系統(tǒng)軟件合規(guī)性 
為滿足企業(yè)客戶需求，達(dá)普生物數(shù)字 PCR 分析軟件 - Astrolabe 合規(guī)版軟件系統(tǒng)功能符合 FDA 21 CFR Part 11 法規(guī)，經(jīng)檢測(cè)保留的數(shù)據(jù)可作為檢驗(yàn)后追溯的有效數(shù)據(jù)來(lái)源，確保生物醫(yī)藥企業(yè)生產(chǎn)、質(zhì)控中數(shù)據(jù)記錄的合規(guī)性。
 
參考文獻(xiàn)：
1. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery；Nat Rev Drug Discov. 2019 May ; 18(5): 358–378. doi:10.1038/s41573-019-0012-9.
2. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR；Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr 1; 25(2): 115–125.Published online 2013 Dec 12. doi: 10.1089/hgtb.2013.131
3. https://en.wikipedia.org/wiki/
 
  達(dá)普生物科技有限公司孵化于香港科技大學(xué)，于 2018 年由多位海歸博士共同創(chuàng)立。在深圳、嘉興、香港三地設(shè)有研發(fā)中心，研發(fā)團(tuán)隊(duì)近百人，建立了集微流控芯片、儀器及試劑生產(chǎn)為一體的 GMP 廠房。
 
公司專注于將液滴微流控技術(shù)應(yīng)用于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，致力于成為集微流控芯片、儀器、試劑的研發(fā)和生產(chǎn)于一體的完整解決方案提供商。公司自主研發(fā)、生產(chǎn)三大技術(shù)平臺(tái)：高通量篩選系統(tǒng)、數(shù)字 PCR 系統(tǒng)和單細(xì)胞組學(xué)系統(tǒng)，應(yīng)用于高通量藥物質(zhì)檢、抗體篩選、生物制品質(zhì)檢、癌癥研究、癌癥早期篩查、靶向治療、無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷和病毒定量檢測(cè)等領(lǐng)域。
 
更多產(chǎn)品 ●彗星高通量篩選系統(tǒng)
1. 基于熒光標(biāo)記及電介泳效應(yīng)推動(dòng)分選，無(wú)損傷；
2. 接駁星海單細(xì)胞建庫(kù)系統(tǒng)，提高建庫(kù)質(zhì)量并降低測(cè)序成本；
3. 接駁星云數(shù)字 PCR 系統(tǒng)，篩選陽(yáng)性液滴，富集微量靶標(biāo) ，降低測(cè)序成本；
4. 快速單克隆抗體細(xì)胞株或轉(zhuǎn)染陽(yáng)性單細(xì)胞篩選。
  ●星云全自動(dòng)數(shù)字PCR系統(tǒng)
1. 專利壓力不敏感液滴生成技術(shù)：液滴生成大小均一，擴(kuò)增更穩(wěn)定；
2. 3.5 分鐘內(nèi)可同時(shí)處理 1-32 個(gè)樣本：上樣靈活，滿足高通量需求；
3. 液滴可回收，接駁彗星高通量篩選系統(tǒng)，后續(xù)用于測(cè)序或目標(biāo)基因檢測(cè)。
  ●星海單細(xì)胞建庫(kù)系統(tǒng)
1. 采用獨(dú)家開發(fā)的水凝膠編碼微球和液滴微流控技術(shù)，性能優(yōu)越；
2. 針對(duì)不同細(xì)胞數(shù)、種類及上樣量，1-4 通道，靈活調(diào)整，使用更加方便；
3. 流程靈活，可以接駁下游流程。
 
 達(dá)普生物ThunderBio
達(dá)普生物科技有限公司致力于成為集微流控芯片、儀器、試劑、耗材研發(fā)生產(chǎn)一體的完整解決方案提供商。自主研發(fā)生產(chǎn)的兩大技術(shù)平臺(tái)：數(shù)字PCR和單細(xì)胞組學(xué)系統(tǒng)。產(chǎn)品適用于癌癥早期篩查、靶向治療、無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷、病毒定量檢測(cè)、高通量藥物和抗體篩選等領(lǐng)域。