AAV核酸滴度定量檢測知多少

隨著基因治療技術日趨完善和臨床經驗不斷積累，監管機構對基因治療產品的質量控制也愈發嚴謹慎微。準確的滴度檢測是AAV基因治療藥物質控的重要組成部分，也是開展臨床研究的前提條件，AAV基因治療臨床試驗檢測方法匯總如下表。
 

	檢測項目	檢測方法
一般理化指標	外觀	直接檢測法
	pH	電位滴定法
	滲透壓	滲透壓測定法
純度	蛋白含量	SDS-PAGE/銀染
	病毒顆粒聚集體	動態光散射
	空殼率	透射電鏡
	OD260/OD280	分光光度計法
	宿主DNA殘留	qPCR
	質粒DNA殘留	qPCR
	HKE293/BSA	ELISA
	核酸酶	ELISA
性能	核酸滴度	qPCR
	轉染效率/感染滴度	TCID50
	基因表達	ELISA
	體外活性
安全性	內毒素	凝膠限度試驗法
	無菌	培養法
	復制型AAV	培養法

其中核酸滴度檢測是以AAV衣殼中所含基因組作為定量依據，測定的是含有目標基因組的AAV濃度。AAV中包含的基因組是其表達蛋白或RNA的前提，是AAV藥物發揮藥效的核心和基礎。目前AAV核酸滴度檢測方法有點雜交法、分光光度計法和qPCR法，qPCR作為第二代PCR方法，是各大研究機構和藥企最廣泛采用的定量方法。然而qPCR技術存在較大局限性，如檢測結果只是相對標準曲線的“相對”定量，且反應容易受qPCR體系中酶或蛋白等成分的干擾，定量結果不夠精準等。
 
ddPCR方法 vs qPCR方法
數字PCR（ddPCR）被稱為第三代PCR技術，與qPCR技術相比具有以下顯著優勢：

• ddPCR無需標準曲線即可對目標分子進行絕對定量；
• ddPCR有更高的準確度，定量CV值通常小于10%；
• ddPCR抗干擾能力更優，有實驗顯示，ddPCR檢測AAV樣本的穩定性高于qPCR技術^[1]。

 
另一組測試數據也顯示^[2]，優化后的qPCR方法中位CV分別為5.35%和4.37%，最大值分別為33.2%和8.7%，而數字PCR用三個獨立引物探針組的中位CV值為2%或更低，且分布更密集，可見數字PCR方法定量更加準確，重復性更高。
 
從監管趨勢來看，美國藥典在細胞和基因治療標準品章節中明確寫道，AAV標準品定量將會使用數字PCR進行定量，可見數字PCR方法在細胞和基因治療領域中絕對定量的突出優勢。
   
達普生物AAV核酸滴度數字PCR定量試劑盒邀請廣大客戶進行內部測試
 
綜上所述，在以AAV為遞送載體的基因治療產品的定量檢測中，ddPCR技術已受到越來越多業內人士的青睞，為了滿足廣大客戶的需求，達普生物即將推出其自主研發的AAV基因組ddPCR精準定量試劑盒。北京西美杰科技有限公司作為達普生物中國總代理，現攜手達普生物開展“AAV核酸滴度數字PCR定量試劑盒免費測試活動”。
 
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達普生物科技有限公司由多位海歸博士共同創立。在深圳、嘉興、香港三地設有研發中心，擁有微流控芯片、儀器及試劑 GMP 廠房。公司專注于將液滴微流控技術應用于精準醫學領域，致力于成為集微流控芯片、儀器、試劑的研發和生產于一體的完整解決方案提供商。公司自主研發、生產的兩大技術平臺：數字 PCR 系統和單細胞組學系統。產品適合應用于癌癥早期篩查、靶向治療、無創產前診斷、病毒定量檢測、高通量藥物和抗體篩選等領域。
 
參考文獻：

1. Dobnik, David, et al.2019:1570.，Dobnik, David, et al. "Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors." Frontiers in microbiology (2019): 1570.
2. Martin Lock, Mauricio R. Alvira, Shu-Jen Chen, and James M. Wilson. Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.HUMAN GENE THERAPY METHODS 25:115–125 (April 2014)