多通道成像的重要性
多色或多通道顯微成像在研究中常用于更好地描述疾病特征，以及更好地了解生物過程。例如在免疫腫瘤學中，有必要研究不同免疫細胞相對于關鍵生物標記物的位置。在神經科學中，了解神經元突觸的復雜性通常需要研究多種蛋白質。在研究連通性時，必須清楚識別不同類型的神經元及其位置。

                   
（圖像： 成年大鼠腦。神經元（Alexa Fluor488，綠色）、星形膠質細胞（GFAP，紅色）、細胞核（DAPI，藍色）。圖像由中國廣州醫科大學附屬第二醫院神經科學研究所和神經內科徐恩教授提供。）

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多色活細胞成像的成功關鍵因素
活細胞成像實驗是了解動態過程的關鍵。這類實驗使我們能夠觀察記錄活體狀態下的細胞，而不會可能因固定或終止不同活體過程而產生干擾性結果。在活細胞顯微成像中使用多通道方法可以同步觀察多個細胞結構和過程，提供生理學方面更重要的結果，從而為測量數據增加相關信息。使用單個熒光團的實驗很常見，但是使用兩個或多個熒光探針對活細胞成像則增加了實驗難度，實驗人員必須仔細考慮幾個要點才能成功。

1. 選擇合適的熒光團：使用兩個或多個熒光信號時，需要最大程度的減少其光譜重疊。
2. 在生理條件下成像
3. 成像方式：寬場顯微成像通常是活細胞成像的首選。目前最常用的寬場顯微成像技術使用 LED 光源和濾光片組。但是，濾光片的帶寬和切換速度會嚴重影響采集靈敏度和成像速度，進而增加光毒性和遺漏活細胞的動態信息。
4. 活細胞成像新方法：高光譜拆分（hyperspectual unmixing）與相量分析（phasor analysis）

                
（插入視頻1，視頻：RPE 細胞分裂的 12 小時共聚焦延時視頻，細胞穩定表達 eGFP-tubulin（青色）和 iRFP-Histone H2B（品紅色）。由美國巴爾的摩約翰霍普金斯醫學院荷蘭實驗室 C. Gliech 提供。荷蘭實驗室致力于研究各種控制染色體精確分布的分子機制，以及有絲分裂錯誤在人體健康和疾病中起到的作用。）

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FluoSync：一種快速而溫和的多色光譜拆分寬場熒光成像方法
FluoSync是一種使用單次曝光同時進行多通道熒光成像的精簡方法。
傳統的熒光成像方法通常按順序對每個通道成像，以減少熒光團之間的串擾，或采用多光譜成像以及后續的線性拆分或基于相量的光譜拆分方法。這些方法都需要進行繁瑣的手動調整或深入理解底層技術，或兩者都需要。徠卡顯微系統通過FluoSync引入了一種綜合方法，在消除復雜性的同時保留了快速溫和成像的優點。FluoSync會捕捉整個可見光光譜中的光子，與窄帶寬濾光片相比，丟棄的信息更少；然后采用基于相量的混合拆分方法分離每個信號，實現可靠的通道分離。   

   
（通過比較發現，與傳統熒光成像方法相比，FluoSync采集速度更快的優勢顯而易見。FluoSync捕捉受激發染料的全發射光譜，因此光子不會被浪費，這使它成為敏感活體樣本弱光成像的理想探測技術）
FluoSync充分利用了基于相量的拆分與線性拆分混合方法的優勢。相量分析用于相似光譜的快速聚類以及光譜去噪和線性拆分，能夠識別染料對每個聚類的單獨貢獻，甚至包括超過 3 種染料的情況。

 
（圖 3。左側所示為藍色、綠色和紅色熒光團的三個單獨光譜。使用相量分析時，每個純光譜都落入相量空間中的特定空間，顏色在一個圓圈上表示，信號清晰度決定了與中心（中間面板）的距離。這些熒光團的任意組合也將落入特定空間。圖中所示是三個熒光團中的每一個與所有三個熒光團的混合體的一種組合。由于任何可能的熒光團組合也將落入“它們的”空間，因此可將光譜平均化以實現去噪。右側圖是一個例子，其中黑線表示平均值 ± 誤差（顯示為灰色區域）。降噪光譜表示所有貢獻熒光團的總和，它很好地填充了曲線下方的面積）

強大的FluoSync，在捕捉顯微圖像信息上具有天生的優勢：
可使用不同的熒光團組合更加自由地進行多通道成像： 您不再受限于使用與顯微鏡的固定濾光鏡組匹配的染料組合。
提升數據生成效率： 能同時采集所有事件而無需管理多組濾光鏡，從而加快了圖像采集過程，提高了對多孔板等大型樣本成像的效率，并且能夠捕捉活體樣本中的快速事件。
增強信心：使用混合光譜拆分方法意味著您無需再擔心串擾。
 
AI驅動的顯微圖像數據分析
圖像采集完成之后，如何進行數據背后的信息挖掘又是一個老大難的問題。有數據指出，圖像采集和分析是研究人員提高工作效率的主要限制因素。 最好的辦法是使用人工智能和機器學習來極大程度地改進和加速圖像采集和分析的進程。
  如果您希望對于“多色活細胞成像”有更多的了解，歡迎關注我們的系列網絡研討會：
 
第一場（英文）：
Leica New Imaging Technology——Get ready to enter the Microhub era
2021年3月4日  周五 | 北京時間10:00am
 
點擊注冊參會
   
 
第二場（中文）：
徠卡顯微成像新技術——歡迎進入多色同時成像新紀元
2021年3月14日 周一 | 北京時間 10:00am

10:00-10:45	Get ready to enter the Microhub era（中文字幕）
10:45-11:00	徠卡多模態顯微成像分析中樞介紹（主講人：趙夢路）

 
 
  趙夢路
徠卡生命科學顯微鏡應用專家
 
2017畢業于中國藥科大學生物醫學工程與分子影像實驗室，主要研究腫瘤標志物配體親和力，腫瘤靶向探針熒光成像、近紅外成像。加入徠卡后主要負責超高分辨顯微鏡STED，FLIM熒光壽命檢測，高端共聚焦FRAP FRET技術支持工作。同時在高端寬場顯微鏡THUNDER、TIRF、Scanner、激光顯微切割技術方面有豐富經驗。 
 
 
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